复发性口腔溃疡口腔微生态的研究

摘要

研究背景、目的和意义: 复发性口腔溃疡（Recurrent Oral Ulcer，ROU），又称“复发性口疮”、“复发性阿弗他溃疡”（Recurrent Aphthous Ulcer，RAU）或“复发性阿弗他口炎”（Recurrent Aphthous Stomatitis，RAS），是专指一类原因不明，具有周期性反复发作但又具自限性的局限性口腔粘膜溃疡性损伤。该病是口腔粘膜病中最常见的溃疡类疾病，患病率高达20%左右，居口腔粘膜病首位。复发性口腔溃疡发病时病变部疼痛剧烈，对患者工作与生活造成重要影响。临床尚无明确有效的治疗方法。因此，ROU的病因及发病机制研究对进一步的临床治疗研究具有重要作用。本病病因至今不清，多方面的病因研究表明，ROU的发生发展可能与多种因素有关。国内外文献已报道的病因方面的研究包括免疫学异常，病毒、细菌感染，微量元素、精神神经因素、遗传因素影响及微循环障碍等，但尚无确切定论。 正常人体的口腔、肠道、呼吸道、泌尿生殖道等，均定植一定数量的细菌，它们与宿主在长期进化过程中形成了一个能独立进行物质、能量交流的动态平衡的微生态系统。定居于口腔中的菌群称为口腔正常菌群，它与宿主呈共栖的关系，他们彼此之间保持着动态平衡，对宿主起着有益和有害的双重作用。口腔中的细菌，在正常情况下对宿主有多种有益的生理作用：如抵抗外来致病菌、产生多种营养物质、促进免疫应答、产生过氧化物歧化酶（SOD）、清除自由基（O2-）及抗肿瘤等作用。一旦微生态平衡遭到破坏，发生菌群失调，上述生理作用发生改变，对宿主可能造成损伤。 有学者提出ROU的发生发展可能与多因素相互作用有关。多方面的病因研究表明，ROU的发生发展可能与多种因素有关。口腔内环境与这些因素有着密切的关系。那么，ROU的发生发展是否与口腔的微生态相关呢？ROU患者口腔微生态是否发生了变化？又是哪些方面发生变化？本研究将从口腔菌群变化及口腔菌群构成的角度，探讨复发性口腔溃疡是否与口腔微生态变化有关，为口腔溃疡的防治探索新的依据。 材料和方法: 一、唾液菌群涂片观察 收集临床唾液标本共62例。将其分为溃疡组、愈合组及正常对照组三组。溃疡组为临床确诊并处于溃疡期的20例ROU患者，其中男性6例，女性14例，平均年龄24．7±3．13岁；愈合组为临床确诊并处于愈合期的21例ROU患者，其中男性9例，女性12例，平均年龄25．9±6．67岁；对照组为无ROU病史的21位健康成年人，其中男性9例，女性12例，平均年龄23．3±2．27岁。所有受试者均符合以下纳入标准：所有受检查者取样前1周内未服用任何抗生素、铋剂、抗酸剂及H2受体拮抗剂，1月内未服用类固醇药物或非类固醇类抗炎药，如阿司匹林等；无其他系统疾病；无其他口腔黏膜病；无中、重度牙周病。 方法：唾液标本直接涂片，革兰氏染色，在显微镜10×100油镜下，选取分布均匀的5个视野，分别计数各视野下细菌中革兰氏阳性球菌（简称G+c）、革兰氏阴性球菌（简称Gc）、革兰氏阳性杆菌（简称G+b）、革兰氏阴性杆菌（简称Gb）所占的构成比，然后求其均值。分析了不同菌群间的比值及构成比的变化。 统计学分析：用SPSS13．0统计学软件，对不同组别四类细菌的构成比及不同菌群间的比值采用单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Dunnett T3法进行两两比较，以P<0．05为差异有统计学意义。 二、复发性口腔溃疡口腔唾液中链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌的定量分析 收集符合纳入标准的临床标本，共95例。纳入标准参考第一章。将其分为溃疡组、愈合组及正常对照组三组。溃疡组为临床确诊并处于溃疡期的39例ROU患者，其中男性13例，女性26例，平均年龄26．3±7．76岁；愈合组为临床确诊并处于愈合期的35例ROU患者，其中男性11例，女性24例，平均年龄25．3±5．47岁；对照组为无ROU病史的21位健康成年人，其中男性9例，女性12例，平均年龄23．3±2．27岁。 方法：用引物设计软件Primerprimer5．0设计三种常见口腔细菌（链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌）16S rRNA基因扩增引物，并验证其特异性；采用改良CTAB/NaCl法提取细菌标本DNA；通过实时荧光定量PCR检测链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌三种常见口腔细菌的含量。 统计学分析：用SPSS13．0统计学软件，对不同组别三种细菌的含量采用单向方差分析（One-way ANOVA），采用Dunnett T3法进行两两比较，以P<0．05为差异有统计学意义。 三、基于细菌16S rRNA基因分析的复发性口腔溃疡口腔细菌构成差异分析 分别收集符合纳入标准的唾液标本30例，纳入标准参考第一章。将其分为溃疡组、愈合组及正常对照组三组，每组10例。溃疡组为临床确诊并处于溃疡期的ROU患者；愈合组为临床确诊并处于愈合期的ROU患者；对照组为无ROU病史的健康成年人。 方法：采用改良CTAB/NaCl法提取细菌标本DNA，并且制备成混合标本。用细菌16S rRNA通用引物扩增混合标本，琼脂糖凝胶电泳，用AlphaEaseFCStand Alone软件行凝胶图像分析。选择回收纯化差异较明显的条带，测定片段序列并在GenBank中比对，分析差异条带的种属源性。 二、复发性口腔溃疡口腔唾液中链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌的定量分析 溃疡组链球菌及韦荣氏菌含量的对数值分别为7．30±0．89和8．29±0．77，均显著低于对照组（8．15±0．55和8．93±0．76，P<0．01），链球菌及韦荣氏菌含量分别较对照组降低了66%和86%；溃疡组与愈合组间链球菌及韦荣氏菌的含量的对数值差异均无统计学意义（P=0．64、P=0．17）；愈合组链球菌含量的对数值为7．51±0．81，显著低于对照组（8．15±0．55，P<0．01），菌量较对照组降低67%，愈合组与对照组间韦荣氏菌含量的对数值差异统计结果P=0．056；奈瑟氏菌含量的对数值在三组间的差异均无统计学意义（P=0．921）。 三、基于细菌16S rRNA基因分析的复发性口腔溃疡口腔细菌构成差异分析 在200～800bp区间，于溃疡组、愈合组及对照组均稳定识别出3条碱基数分别为230bp、400bp及770bp左右的三条条带。溃疡组、愈合组及对照组三条条带灰度值的百分比有差异。在溃疡组、愈合组及对照组条带组成方面存在差异，各组在不同位置均有条带缺失现象。条带综合波形图也反映了溃疡组、愈合组及对照组在条带含量构成方面存在差异。选择回收纯化片段暂命名为1号，片段大小约为180bp。测序结果通过生物信息学分析。1号blast比对结果示1号差异条带70%与GenBank中Bacteroides vulqatus ATCC8482同源，匹配率74%。 结论: 1.溃疡组、愈合组及对照组唾液菌群以球菌为主，溃疡组革兰氏阴性球菌构成比减少，表明复发性口腔溃疡唾液菌群构成发生了变化。 2.复发性口腔溃疡患者唾液中链球菌、韦荣氏菌含量发生了减少性变化，提示构成口腔微生态的重要球菌菌群链球菌和韦荣氏菌含量的改变与复发性口腔溃疡的发生发展有关。 3.细菌16S rRNA基因扩增琼脂糖电泳及图像分析结果表明，复发性口腔溃疡患者口腔细菌构成与健康成人的口腔细菌构成存在差异。 概言之，复发性口腔溃疡患者口腔菌群构成比及含量均发生了变化，提示复发性口腔溃疡的发生发展与口腔微生态的变化有关。临床上对复发性口腔溃疡的治疗应注意口腔微生态的调整和改善。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章 唾液标本菌群涂片观察

第二章 复发性口腔溃疡口腔唾液中链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌的定量分析

第三章 基于细菌16S rRNA基因分析的复发性口腔溃疡口腔细菌构成差异分析

全文小结

附录 英文缩写注释

硕士期间发表论文

致谢

研究生毕业论文统计学审稿证明