不同剂量厄贝沙坦对糖尿病大鼠心肾骨桥蛋白表达及纤维化的影响

摘要

研究背景：
　　 糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是一种特异性心肌病,是导致糖尿病患者晚期死亡的主要因为之一。其主要病理改变是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)积聚和心肌间质纤维化。DCM的发病是多种致病因素相互作用的结果,其中心肌局部。肾素.血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem,RAS)活性的增高是导致DCM发生发展的重要因素。此外,肾脏局部RAS的异常激活亦是触发糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的重要致病因素之一。
　　 近年来研究表明骨桥蛋白(Osteopomin,OPN)在促进心肌及肾小管间质纤维化中具有重要作用。OPN作为一种强大的巨噬细胞趋化因子,促使巨噬细胞到达肾间质,从而与巨噬细胞表面的OPN受体结合,释放TGF-β1、PDGF、IL-1等细胞因子,分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、纤维连接蛋白、硫酸软骨素等细胞外基质成分,从而促进小管间质纤维化及肾功能损伤。其次,OPN本身可作为致纤维性细胞因子促进成纤维细胞的迁移、黏附及增殖；OPN可与胶原、纤维连接蛋白及蛋白多糖相互作用,形成稳定的复合物,促进ECM成分的合成及转化,从而促进组织纤维化。此外,研究发现OPN基因的启动了有TGF-β的结合元件,提示OPN可受TGF-β的调控,亦有研究显示OPN受RAS的调节,且参与AngⅡ诱导的纤维化过程。
　　 本课题采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的T1DM大鼠模型作为研究对象,观察不同剂量厄贝沙坦(Irbesartan,Irb)对糖尿病大鼠心脏和肾脏形态的保护作用,以及对心脏、肾脏TGF-β1、OPN的影响,并以肼屈嗪作为降压阳性对照,探讨糖尿病状态下厄贝沙坦是否通过抑制OPN的表达而减轻心肌及小管间质纤维化,从而为减轻糖尿病心肌及小管间质纤维化提供新的治疗策略。具体研究分为以下两个部分:
　　 第一章 不同剂量厄贝沙坦对糖尿病大鼠心肌骨桥蛋白表达及纤维化的影响
　　 [目的]
　　 1、观察不同剂量厄贝沙坦对STZ诱导的糖尿病大鼠心肌间质纤维化、TGF-β1、OPNmRNA表达的影响；
　　 2、探讨厄贝沙坦减轻心肌间质纤维化的可能机制及其剂量相关性。
　　 [方法]
　　 1、糖尿病大鼠模型的制备和分组:63只8周龄雄性Wistar大鼠(购于南方医科大学实验动物中心),体重240-280g。按体重分层后随机数将大鼠分为3组:
　　 (1)Ctrl组:正常对照组(n=7)；(2)DM组:糖尿病对照组(n=14)；(3)药物干预组(n=42)。各组大鼠隔夜禁食14-16h后,给予DM组和药物干预组大鼠一次性腹腔沣射STZ(55mg/Kg体重,溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液,pH4.5),Ctrl组注射等体积的0.1mol/L柠檬酸缓冲液,72h后尾静脉采血,用快速血糖仪(One touch ultra)测定全血血糖,血糖>16.7mmol/L为糖尿病造模成功。STZ注射后72h内,DM组死亡3只,药物干预组死亡6只。药物干预组糖尿病大鼠按体重再次随机分为4组,于造模成功4周后分别给予25mg/kg·d厄贝沙坦(DM+Irb25组,n=9)、50mg/kg·d厄贝沙坦(DM+Irb50组,n=9)、200mg/kg·d厄贝沙坦(DM+Irb200组,n=9)和30mg/kg·d肼屈嗪(DM+Hyd组,n=9)干预8周。造模后前4周,对血糖值≥30mmol/L的糖尿病大鼠予皮下注射长效胰岛素来得时(Sanofi-anvitis公司,法国),2-4U/隔日,以避免酮症的出现和保持大鼠活力。
　　 2、厄贝沙坦(Sanofi-anvitis公司,法国)及肼屈嗪(Sigma公司,美国)用药根据大鼠体重计算。溶于清洁饮水中灌胃给药,每天一次。正常对照组和糖尿病对照组给予相应体积饮水灌胃。所有大鼠饲养于恒温清洁环境(南方医科大学实验动物中心),自由进食及饮水。
　　 3、给药前及给药8周后,采用Powerlab生物信息采集系统(Adinstrument,澳大利亚)测大鼠尾动脉收缩期血压,待大鼠平静后,连续测鼠尾动脉收缩期血压三次,取其平均值为该鼠收缩期血压值。
　　 4、标本的留取:给药8周后,大鼠麻醉,经腹主动脉插管取血,立即用4℃PBS灌注,待PBS颜色澄清后,开胸取心。取0.5×0.5×0.5cm3左室心肌组织,置于10％中性福尔马林缓冲溶液中固定,其余组织立即放入冻存管于液氮中保存。
　　 5、心肌组织Masson染色:10％中性福尔马林缓冲溶液固定,常规脱水、浸蜡、包埋。2 μm石蜡切片,Masson染色,光镜下观察心肌组织胶原纤维沉积。运用Image-Pro Plus 6.0彩色图像分析系统半定量胶原纤维表达情况。
　　 6、心肌组织AngⅡ的测定:从液氮中取出冻存的心肌组织移入1.5ml的EP管中,用冰浴的0.9％生理盐水冲洗,剪碎,加入1mL0.1 mol/L的醋酸中,用匀浆器制成匀浆,95℃水浴10min,冷却后4℃,15000rmp,离心20 min,吸取上清液。按大鼠血管紧张素Ⅱ ELISA试剂盒说明书进行操作。
　　 7、心肌组织TGF-β1、OPNmRNA的测定:Trizol法提取心肌组织总RNA,逆转录试剂盒转录为cDNA。Real-time PCR检测心肌组织中TGF-β1、OPNmRNA表达情况。以β-actin作为内参。
　　 8、统计分析:所有数据由SPSS13.0统计软件处理,以均数±标准差((x)±SD)表示,符合正态分布和方差齐性时用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA),进一步组间多重比较采用LSD法。不满足方差齐性用Welch法对F值进行校正,进一步多重比较用Dunnett T3法。P<0.05为差异有统计学意义。
　　 [结论]
　　 1、糖尿病状态下,心脏局部RAS被激活,AngⅡ水平显著升高,给予不同剂量厄贝沙坦干预后,心肌组织AngⅡ水平显著减少,且具有一定的剂量相关性。
　　 2、厄贝沙坦可显著减少心肌组织TGF-β1、OPNmRNA表达,从而减轻心肌间质纤维化,这可能是厄贝沙坦改善心室重构的机制之一。
　　 3、厄贝沙坦在降压效果劣于肼屈嗪的情况下,减少心肌组织TGF-β1、OPNmRNA表达,减轻心肌纤维化程度显著优于肼屈嗪,提示厄贝沙坦有独立于降压作用之外的心脏保护作用。
　　 第二章 不同剂量厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏骨桥蛋白表达及纤维化的影响
　　 [目的]
　　 1、观察不同剂量厄贝沙坦对STZ诱导的糖尿病大鼠肾小管间质纤维化、TGF-β1、OPNmRNA表达的影响；
　　 2、探讨厄贝沙坦减轻肾小管间质纤维化的可能机制及其剂量相关性。
　　 [方法]
　　 1、糖尿病大鼠模型的制备和分组 同第一章
　　 2、厄贝沙坦、肼屈嗪灌胃给药 同第一章
　　 3、标本的留取:给药8周后,大鼠麻醉,经腹主动脉插管取血后,立即用4℃PBS灌注后取肾。迅速剥去肾包膜,纵向剖开肾脏,切取约0.5×0.5×0.2cm3大小的组织,置于10％中性福尔马林缓冲溶液中固定。
　　 4、肾组织形态学观察及Masson染色:10％中性福尔马林缓冲溶液固定,常规脱水、浸蜡、包埋。2μm石蜡切片,过碘酸雪夫氏染色(PAS染色),光镜下观察肾组织形态学变化。Masson染色,光镜下观察肾小管间质胶原纤维沉积。运用Image-Pro Plus 6.0彩色图像分析系统半定量胶原纤维表达情况。
　　 5、肾组织AngⅡ的测定:从液氮中取出冻存的肾组织移入1.5ml的EP管中,用冰浴的0.9％生理盐水冲洗,剪碎,加入1mL0.1 mol/L的醋酸中,用匀浆器制成匀浆,95℃水浴10min,冷却后4℃,15000rmp,离心20 min,吸取上清液。按大鼠血管紧张素Ⅱ ELISA试剂盒说明书进行操作。
　　 6、肾组织TGF-β1、OPNmRNA的测定:Trizol法提取。肾组织总RNA,逆转录试剂盒转录为cDNA。Real-time PCR检测肾组织中TGF-β1、OPNmRNA表达情况。以β-actin作为内参。
　　 7、统计分析:所有数据由SPSS13.0统计软件处理,以均数±标准差((x)±SD)表示,符合正态分布和方差齐性时用单因素方差分析(ONE-WAYANOVA),进一步组间多重比较采用LSD法。不满足方差齐性用Welch法对F值进行校正,进一步多重比较用Dunnett T3法。P<0.05为差异有统计学意义。
　　 [结论]
　　 1、糖尿病状态下,肾内RAS被激活,AngⅡ水平显著升高,给予不同剂量厄贝沙坦干预后,肾内AngⅡ水平显著减少,且具有一定的剂量依赖性。
　　 2、厄贝沙坦可改善肾小球肥大,系膜基质增生,减轻肾小管间质纤维化；减少肾内TGF-β1、OPNmRNA表达,这可能是厄贝沙坦减轻小管间质纤维化的机制之一。
　　 3、厄贝沙坦在降压效果劣于肼屈嗪的情况下,其保护肾脏结构、减轻小管间质纤维化的作用显著优于肼屈嗪,这提示厄贝沙坦有独立于降压作用之外的肾脏保护作用。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 不同剂量厄贝沙坦对糖尿病大鼠心脏骨桥蛋白表达及纤维化的影响

第1节 实验材料

第2节 实验方法

第3节 结果

第4节 讨论

第5节 结论

第二章 不同剂量厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏骨桥蛋白表达及纤维化的影响

第1节 实验材料

第2节 实验方法

第3节 结果

第4节 讨论

第5节 结论

参考文献

英文缩写词表

致谢

统计学证明