F10基因对A549细胞凋亡、化疗敏感性及致瘤性的影响

摘要

研究背景和目的：
　　 F10基因是本课题组在已完成的国家973课题研究过程中，采用抑制性消减杂交的方法，从葡萄胎与正常早孕绒毛的差异cDNA文库中筛选出的一条功能未知新基因(GenBank登录号AB196290)。由于该基因在消减杂交过程中，是将其保存在96孔板第F10孔的位置，故以F10暂时命名该基因。前期的研究表明，F10基因在葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒痛中均呈阳性表达且依次增强，在卵巢腺癌、子宫内膜痛等妇科肿瘤中亦呈阳性表达，但在正常子宫内膜和宫颈上皮组织中呈阴性表达。可见，F10基因可能是一种与葡萄胎的恶性变及妇科恶性肿瘤的发生有关的新基因。由于目前妇科恶性肿瘤仍是威胁广大妇女健康的主要疾病，因此，F10基因作为一种与葡萄胎的恶性变及妇科肿瘤发生相关的新基因，其功能研究对于揭示此类肿痛的发病机制、指导临床治疗具有重要意义。
　　 目前最为常见的基因功能研究方法是基因转导技术，而适宜的基因转导载体对于基因的转导效率和持续稳定过表达起着关键作用。增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，在488nm激发波处，能形成鲜明的绿色荧光。在组织和细胞中，EGFP能耐受各种处理而保持其发光特性。
　　 本研究拟采用基因转导技术，研究以下内容：(1)以F10基因低表达的A549细胞为细胞模型，以pEGFP-N1作为真核表达载体，构建稳定过表达F10基因的A549细胞系；(2)在此基础上，探讨F10基因过表达对肺癌A549细胞凋亡的影响及机制；(3)选取紫杉醇为化疗药物，研究F10基因过表达对A549细胞化疗药物敏感性的影响；(4)将过表达F10基因的A549细胞接种裸鼠，观察F10基因对A549细胞在裸鼠体内致瘤性的影响，并通过检测与细胞凋亡密切相关的CASPASE-3、BAX和BCL-2的表达，进一步探讨F10基因影响A549细胞致瘤性的作用机制。
　　 本课题属原始创新性研究，通过研究葡萄胎高表达的F10基因对A549细胞凋亡、化疗敏感性及致瘤性的影响，期望在F10基因功能的研究中有所突破，为将来发展基于F10基因的妇科肿瘤防治新措施提供理论支持。
　　 第一章 稳定过表达F10基因的A549细胞株的建立及鉴定
　　 F10基因是一种功能未知的新基因，在肺癌A549细胞中呈现低表达。pEGFP-N1载体含有EGFP，可在488nm激发波处，形成鲜明的绿色荧光，标记基因的表达情况，并且具有复制力强、含高效强大启动子和多克隆位点、含可供G418筛选的新霉素耐药标记的基因neo等特点，这些特殊结构使得它作为一种真核表达载体，能够使目的基因在靶细胞内稳定过表达。基于这种理论，我们采用基因转导技术，以pEGFP-N1为载体，将外源性F10基因导入A549细胞，期望建立一种稳定过表达F10基因的A549细胞株，为进一步研究F10基因的生物学功能提供一个实验平台。
　　 研究方法
　　 设计并构建重组质粒pEGFP-N1-F10和pEGFP-N1-Mock，经EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切、DNA测序鉴定正确后，转染A549细胞株，经G418筛选，获得阳性单克隆细胞株。利用荧光定量PCR技术鉴定阳性克隆。
　　 小结
　　 1.以pEGFP-N1为真核表达载体，设计并构建出pEGFP-N1-F10重组质粒，对pEGFP-N1-F10质粒进行酶切和测序，结果证实F10基因已成功连接至pEGFP-N1载体。
　　 2.以F10基因低表达的肺癌A549细胞为细胞模型，将pEGFP-N1-F10质粒转染A549细胞，经G418筛选，获得阳性单克隆细胞。利用荧光定量PCR鉴定阳性克降，发现F10基因过表达组A549细胞中F10 mRNA的表达显著高于阴性对照组A549细胞，提示稳定过表达F10基因的A549细胞系成功构建，这为进一步研究F10基因的生物学功能提供了一个实验平台。
　　 第二章 F10基因过表达对A549细胞株凋亡的影响
　　 细胞凋亡受到多种基因调控，涉及多种酶的参与调节，其中CASPASE-3和BAX是调控凋亡的两个重要因子。而近年来的研究表明，肿瘤的发生发展与细胞凋亡受抑密切相关。基于这些理论，我们利用已建立的稳定过表达F10基因的A549细胞株，观察F10基因过表达对肺癌A549细胞株凋亡的影响，并通过检测与细胞凋亡密切相关的BAX和CASPASE-3的表达，探讨F10基因影响A549细胞凋亡的机制。
　　 研究方法
　　 利用已建立的稳定过表达F10基因的A549细胞株，并设F10+A549细胞为实验组，Mock-A549细胞为阴性对照组，A549-WT细胞为空白对照组。采用MTT检测细胞体外增殖能力，TUNEL-FITC/Hoechst33258检测细胞凋亡情况，RT-PCR检测各组细胞BAX和CASPASE-3 mRNA表达，Western Blot检测各组细胞BAX和CASPASE-3蛋白表达，并采用析因设计方差分析和单因素方差分析比较各组之间上述指标的变化。
　　 小结
　　 1.利用MTT检测细胞体外增殖能力，发现从12h开始，F10基因过表达组A549细胞较阴性对照组和空白对照组生长增快，提示F10基因促进A549细胞增殖。同时，采用TUNEL-FITC/Hoechst33258染色检测细胞凋亡，发现阴性对照组和空白对照组A549细胞中出现凋亡现象的细胞均明显较F10基因过表达组多，提示F10基因过表达抑制A549细胞凋亡。
　　 2.采用RT-PCR和Western Blot检测技术，发现F10基因过表达组A549细胞中BAX和CASPASE-3的mRNA和蛋白表达均低于阴性对照组和空白对照组，表明F10基因下调A549细胞中CASPASE-3和BAX表达，两者参与了对凋亡的调控，提示F10基因过表达抑制A549细胞凋亡。
　　 第三章 F10基因过表达对A549细胞株紫杉醇化疗敏感性的影响
　　 化疗是治疗恶性肿瘤的重要方法，传统的肿瘤治疗观念是化疗药物直接作用于核酸、微管蛋白及其它靶点以杀伤肿瘤细胞；现在认识到化疗药物也可以通过诱导细胞凋亡而杀伤肿瘤细胞。近年来发现紫杉醇(TAXOL)即是通过凋亡机理发挥抗肿瘤效应，在治疗肺痛等肿痛中被广泛应用。基于上述理论，我们以稳定过表达F10基因的A549细胞株为平台，选取紫杉醇为化疗药物，研究F10 基因过表达对化疗药物敏感性的影响，并通过检测与细胞凋亡密切相关的CASPASE-3和BAX的表达，探讨F10基因影响A549细胞化疗敏感性的机制。
　　 研究方法
　　 利用已建立的稳定过表达F10基因的A549细胞株，并设F10+A549细胞为实验组，Mock-A549细胞为阴性对照组，A549-WT细胞为空白对照组，分别给予紫杉醇处理。采用MTT检测细胞体外增殖能力，TUNEL-FITC/Hoechst33258检测细胞凋亡情况，RT-PCR检测各组细胞BAX和CASPASE-3 mRNA表达，Western Blot检测各组细胞BAX和CASPASE-3蛋白表达，并采用析因设计方差分析和单因素方差分析比较各组之间上述指标的变化。
　　 小结
　　 1.利用MTT和TUNEL-FITC/Hoechst33258染色检测技术，发现经紫杉醇处理后，阴性对照组和空白对照组A549细胞均较F10基因过表达组生长持续减慢，凋亡细胞增多，提示F10基因过表达抑制A549细胞对紫杉醇化疗的敏感性。
　　 2.采用RT-PCR和Western Blot检测技术，发现经紫杉醇处理后，F10基因过表达组A549细胞中BAX和CASPASE-3的mRNA和蛋白表达均低于阴性对照组和空白对照组，表明F10基因下调紫杉醇处理后的A549细胞中CASPASE-3和BAX表达，提示F10基因可下调A549细胞中CASPASE-3和BAX表达，进而抑制其对紫杉醇的化疗敏感性。
　　 第四章 F10 基因过表达对A549细胞株致瘤性的影响
　　 自课题组发现F10基因以来，我们前期的工作主要集中于细胞水平上的研究，而裸鼠成瘤实验则可以模拟人体内环境，在动物活体上观察F10基因对肿瘤细胞致瘤性的影响。因此，我们将前期建立的稳定过表达F10基因的肺癌A549细胞株接种裸鼠，观察F10基因对A549细胞在裸鼠体内致瘤性的影响，并探讨其机制。
　　 研究方法
　　 利用已构建的过表达F10基因的A549细胞株，制备裸鼠肺癌动物模型，致瘤小鼠随机分为A549-WT、Mock-A549和F10+A549三组。通过裸鼠成瘤实验来确定F10基因对肺癌A549细胞在裸鼠体内致瘤性的影响，应用免疫组化检测成瘤组织中CASPASE-3、BAX和BCL-2的蛋白表达，并采用单因素方差分析和重复测量方差分析比较各组之间上述指标的变化。
　　 小结
　　 将稳定过表达F10基因的肺癌A549细胞株接种裸鼠，发现F10基因过表达组A549细胞接种后的肿瘤，其成瘤时间缩短、瘤体积增加，肿瘤生长速度加快，免疫组化检测显示出相对于对照组较低的CASPASE-3和BAX表达水平以及较高的BCL－2表达水平。提示F10基因通过下调CASPASE-3和BAX的表达、上调BCL-2的表达，增强了肺癌A549细胞株在裸鼠体内的致瘤性。

目录

文摘

英文文摘

前言

参考文献

第一章 稳定过表达F10基因的A549细胞株的建立及鉴定

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、小结

五、参考文献

第二章 F10基因过表达对A549细胞株凋亡的影响

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、小结

五、参考文献

第三章 F10基因过表达对A549细胞株紫杉醇 化疗敏感性的影响

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、小结

五、参考文献

第四章 F10基因过表达对A549细胞株致瘤性的影响

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、小结

五、参考文献

全文小结

附录一 综述

参考文献

附录二 F10基因相关序列资料

附录三 缩略语一览表

攻读学位期间取得的学术成果

致谢

统计学证明