纳米高聚合物转导survivin反义寡核苷酸对大肠癌的体内杀伤作用研究

摘要

研究背景：
　　 大肠癌是最常见恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈上升趋势。我国年均新发大肠癌病例约13万,并以年均4％的增幅不断攀升；中国发达地区的大肠癌发病率较三十年前增长了两倍多,已经接近西方发达国家水平；而香港地区大肠癌发病率在2009年已超越肺癌成为第一大癌症。目前对大肠癌的主要治疗手段是以手术治疗为主、放化疗等多种治疗手段相结合的综合治疗。随着对大肠癌发生发展机制认识的逐步深入,当前正在进行分子靶点药物、抗血管增生、基因治疗等多种新的治疗方法研究。基因治疗因其具有特异性、安全性、有效性的特点而受到越来越多的关注,基因治疗己与手术、化疗、放疗共同构成目前肿瘤治疗的四种手段。
　　 现代肿瘤学研究发现细胞增殖和细胞凋亡失常是普遍现象,正常机体的修复和免疫监视机制可以修正机体细胞发生的异常增生和变异,消除变异的细胞,防止肿瘤的发生。肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡失衡所致,凋亡抑制是肿瘤发生的重要机制。对肿瘤发生发展的分子机制研究表明,在肿瘤发生发展过程中,细胞凋亡起了非常重要的作用。在正常情况下,细胞遭受DNA损伤后,首先将启动修复途径进行修复。在细胞损伤无法修复时,细胞将启动凋亡途径进行自发性的程序性死亡。在凋亡途径发生异常后,细胞将积累突变并最终发展为癌。凋亡通路的紊乱、促进凋亡因子的抑制、凋亡抑制因子过表达以及凋亡基因的表达失控都会导致肿瘤的发生、发展。因此凋亡异常在肿瘤的发生发展中起到举足轻重的作用。
　　 凋亡的调节机制非常复杂,也是目前的分子生物学研究热点。近年发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)是一类重要的分子水平的抗凋亡调节因子。IAP家族具有多种生物学功能,包括结合并抑制caspase蛋白,从而抑制细胞凋亡、参与细胞膜受体介导的信号传导通路调节、参与细胞周期调控。它们的过度表达可以引起肿瘤细胞的抗凋亡作用,因而与肿瘤的发生和发展密切相关。IAP家族结构功能相似,但组织分布差异很大。Survivin是IAP家族成员之一,且是迄今发现的最强的凋亡抑制因子,survivin在癌组织中的表达与恶性肿瘤的侵袭性、预后均有一定关系。与其它的IAP家族成员不同,survivin在人胚胎组织中高度表达并参与胚胎发育过程中的组织分化和器官形成,在终末分化的成人组织中未有检出,但广泛表达于多种肿瘤组织。有研究显示近乎所有的常见癌症中,Survivin的mRNA和蛋白都有过量表达,这一普遍分布现象表明,Survivin基因在癌症中处于失控的表达状态。而且Survivin表达往往与肿瘤降低的凋亡指数和增高的增殖活性有关,表明Survivin可能是参与多数肿瘤发生的共同机制。由于在肿瘤组织中的特异性分布,Survivin已成为肿瘤基因治疗的新的重要靶点。
　　 基因治疗的最终目的是在一个合适的系统中高效表达外源基因,使遗传物质在转导细胞中持久整合及稳定表达。反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASODN)技术的基本原理是根据Watson-Crick碱基互补配对规律和核酸杂交原理,设计出能与靶基因特定区域结合的互补反义寡核苷酸片段,与靶基因(DNA)或信使核糖核酸(mRNA)的特定序列相结合,以影响靶基因的表达,抑制或消除其功能,而其他基因的转录和表达则不受影响。其作用于遗传信息的上游且能特异性地阻断细胞内单一基因的表达,而不影响其他基因的正常功能,因此所需剂量较小、药效高,同时具有特异性强、低毒副作用等优点。由于survivin只在胚胎和恶性肿瘤组织中表达,在正常组织中基本不表达,因此反义survivin基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性。但ASODN是亲水性的多聚阴离子聚合物,具有不易透过细胞膜、细胞难于吸收、胞内积累少以及易受血浆和细胞内的核酸酶降解的缺点,因此限制了其在临床中的应用。研制高效实用的载体传递ASODN,则有可能发挥反义survivin基因治疗的优势,使以survivin为靶点的基因治疗成为可能。
　　 要按设计的目标完成基因治疗,寻找或研制有效的基因载体是重要的步骤之一。目前的病毒载体和非病毒脂质体载体都存在不同程度的缺陷,因而寻找一种理想的基因载体就成为当务之急。纳米基因转运体的研制是目前国际纳米生物和肿瘤基因治疗研究领域重要的前沿性课题。纳米微粒((nanoparticles,NP)一般是指粒径在10～100nm之间的超微固态胶状粒子,其大小介于原子簇和微粒子之间,因而具有许多普通材料所不具备的特性,如表面效应、小尺寸效应、宏观量子效应和界面效应等。以纳米微粒作为基因转移载体就是将DNA、RNA、寡核苷酸等生物活性分子包裹在纳米微粒内部或吸附在其表面,通过一系列复杂的过程释放出这些活性分子,从而发挥基因治疗的作用。目前的研究及本团队前期的实验已证实采用纳米微粒做为基因递送系统具有许多优越性:1)可生物降解材料制备的纳米粒无毒,无免疫原性,与机体有良好的生物相容性；2)可控制基因释放,延长其体内表达的半衰期；3)可装载多种基因,其容量理论上无限制,同时可附载基因表达促进剂；4)可实现外源基因的靶向性传输。因此,纳米微粒是理想的体内基因递送系统,具有良好的应用前景。聚酰胺-胺型树状大分子(polyamidoamine,PAMAM)是近年来国外开发的一类新型功能高聚合物分子,其分子在结构上具有很多特性,如高度的几何对称性、精确的分子结构、大量的官能团、分子内存在空腔及分子链增长具有可控性等等。已有的研究表面,以PAMAM为载体均较其它阳离子载体(如脂质体、多聚赖氨酸)有更高的基因转移率；PAMAM-survivin-ASODN转染复合物具有粒径小、zeta电位高、基因包封率及载药率高的特点,对基因有缓慢释放的作用并可抵御酶的降解。
　　 基于上述研究,本课题拟应用PAMAM作为survivin-ASODN的载体,配制成纳米转染复合物,并通过实验观察survivin-ASODN对裸鼠大肠癌SW620细胞移植瘤的体内抑瘤效应,为进一步开展大肠癌的基因治疗研究提供新的思路。
　　 目的：
　　 研究PAMAM作为survivin-ASODN转染载体的可行性并观察经PAMAM转导的survivin-ASODN在裸鼠体内的抗肿瘤作用。
　　 方法
　　 一、PAMAM-survivin-ASODN转染复合物的合成。
　　 二、PAMAM介导的survivin反义寡核苷酸对大肠癌SW620细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应。
　　 采用BALB/C雌性裸鼠18只,4～6周龄,每只体重约16g,取对数生长期的SW620细胞(约4.0×106个/ml,0.5ml)接种于裸鼠腹部皮下,建立大肠癌动物模型,当肿瘤达直径0.5cm时,将荷瘤裸鼠随机分为3组,A组:阴性对照组(瘤体及瘤周注射LipolifectmainTM2000与PAMAM)；B组:脂质体-survivin-ASODN治疗组(瘤体及瘤周注射脂质体-survivin-ASODN转染复合物)；C组:PAMAM-survivin-ASODN治疗组(瘤体及瘤周注射PAMAM-survivin-ASODN转染复合物)。治疗前后测量肿瘤体积,治疗结束后测肿瘤重量,计算肿瘤抑瘤率,观察该治疗体系的体内抗肿瘤效应。治疗结束后行肿瘤组织内survivin基因表达的检测,透射电镜观察肿瘤细胞的超微结构变化及心、肝、肺、肾组织病理检查。
　　 结论
　　 1.Survivin-ASODN对大肠癌裸鼠移植瘤具有明显的抑制作用,PAMAM-survivin-ASODN转染复合物较脂质体-survivin-ASODN转染复合物具有更强的抗肿瘤作用；
　　 2.Survivin在裸鼠移植瘤细胞中有高度表达,PAMAM介导转染针对survivinmRNA的反义寡核苷酸可在mRNA及蛋白两个水平上有效地降低裸鼠移植瘤细胞内survivin的表达；
　　 3.survivin-ASODN对裸鼠移植瘤细胞的抗肿瘤作用机制为诱导靶细胞的凋亡；
　　 4.PAMAM介导survivin-ASODN治疗后,荷瘤裸鼠心、肺、肝、肾等器官无明显组织学变化,提示该系统对荷瘤裸鼠无近期系统毒副作用。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

参考文献

第二章 纳米高聚合物转导survivin反义寡核苷酸对大肠癌的体内杀伤作用研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 凋亡抑制因子Survivin与大肠癌的研究进展

参考文献

附录 中英文对照缩略词表

攻读学位发表论文

致谢

统计学合格证明