炎症对骨折愈合过程中成骨细胞分化的影响及分子机制

摘要

一、研究背景
　　 骨折愈合过程如果伴随感染可导致愈合明显延迟甚至骨不连发生。骨形成过程就是骨骼中的成骨细胞活性与破骨细胞活性这一相互拮抗、制约的矛盾统一体的平衡过程,其中成骨细胞的作用为合成骨基质,由间充质干细胞(MesenchymalStem Cell,MSCs)分化而来；破骨细胞的作用为降解骨基质,由骨髓单核巨噬细胞分化演变而成。骨折愈合过程中需要大量新的成骨细胞产生,从而加快骨质合成与钙化,增加骨的体积和密度。慢性持续性炎症可刺激骨吸收,此方面研究已较成熟。但慢性持续性炎症对骨形成过程中成骨细胞分化的影响,尤其是对间充质干细胞分化成为成骨细胞过程的影响至今却所知甚少,目前国内外尚缺乏研究,而此类研究对指导临床实践具有重要意义。核转录因子NF-kB(nuclear factorkappa B)是炎症反应中关键的转录因子,在炎症反应中扮演着举足轻重的关键角色。骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)、核心结合因子(Runt-relatedtranscription factor2,Runx2)等信号通道是控制成骨细胞分化的关键因素。因此,本课题重点研究NF-κB对成骨细胞分化过程中关键的BMP-Smad通道、Runx2信号通道的影响,并探索拮抗炎症因子活性进而有效促进成骨细胞分化的化合物,是以全新方位研究促进骨折愈合的新思路。
　　 炎症分为细菌性和无菌性炎症。细菌毒素(如LPS)及细胞碎片和外来物(如金属固定架和固定髓内针、钢板引入的金属颗粒等)均可刺激细胞产生很多细胞因子(如TNF-α等),进而诱导激活炎症反应相关的转录因子如NF-κB等,从而发生一系列炎症反应。NF-κB是炎症反应中关键的转录因子,它控制着很多与细胞生存与繁殖有关的基因的表达,在炎症反应中扮演着举足轻重的关键角色。NF-κB是由p65和p50两个亚单位组成的符合体,IκBα(IKappa B alpba)通过与NF-κB结合而使其失去活性,而TNFα、LPS等可以通过激活NF-κB抑制蛋白激酶(IκB Kinase,IKK),使IκBα磷酸化并最终降解,从而释放NF-κB复合物,使其得以进入细胞核内,通过与其下游信号蛋白及其启动子的结合而激活其表达。
　　 当骨折发生时,附近骨髓中的间充质干细胞在细胞外基质和损伤部位的各种细胞因子刺激激活下发育分化成为成骨细胞。间充质干细胞分化发育形成成骨细胞的过程存在着一个复杂精密的调节体系,涉及多个骨生成有关的信号转导通道,如BMP-Smad,Runx2/Cbfa1、成骨细胞特异性转录因子(Osterix)、基因启动子(Lrp5)等,其中骨特异的转录因子Runx2和Osterix作用极为关键。动物试验结果显示,敲除Runx2基因的小鼠由于没有骨的产生而不能存活,Osterix也是一样,它们是成骨细胞分化的主控制开关,作用尤其重要。Runx2和Osterix的调控有很多机制,BMP-Smad信号转导通路是其中之一,细胞外的BMP-2通过与细胞膜表面的BMP受体结合并激活受体,BMP受体位于细胞内的部分可以磷酸化激活Smad1、Smad5或Smad8,使其与Smad4结合并进入细胞核,通过对多种相关的信号转导通道(包括Runx2和Osterix)的影响,从而诱导多种骨形成有关的蛋白质活化而刺激骨形成。由于BMP-Smad、Runx2等信号通道是控制成骨细胞分化的关键因素,本课题以BMP2诱导肌源前体细胞C2C12分化形成成骨细胞为模型,研究炎症因子TNF-α对成骨细胞分化的影响及其规律、分子机制和可能的改善措施,重点研究NF-κB对成骨细胞分化过程中关键的BMP-Smad通道、Runx2信号通道的影响,并探索有效促进成骨细胞分化拮抗炎症因子活性的新措施,对今后更好的指导临床实践中骨折愈合具有极为重要的意义。
　　 二、研究目的：
　　 1.研究炎症因子对成骨细胞分化的影响及其规律:炎性因子TNF-α对体外培养的成骨细胞分化的影响及其规律。
　　 2.研究炎症因子影响成骨细胞分化的分子机制:通过炎症有关的转录因子NF-κB和其超级拮抗物IκBα-SR对成骨细胞分化过程中各种信号转导机制(包括BMP-Smad通道和Runx2通道)的影响,来确定其作用途径和分子机制。
　　 3.研究NEMO结合域(NBD)多肽改善TNF-α抑制成骨细胞分化的效果。
　　 三、研究方法
　　 1.细胞培养与传代:
　　 C2C12细胞系培养于DMEM/F12培养基(含10％小牛血清)中,于5％CO2孵箱内培养,温度37℃。对照组和实验组均接种于12孔培养板上贴壁培养。
　　 2.成骨细胞分化测定-ALP染色:
　　 C2C12细胞用BMP-2(100ng/ml)、TNF-α(5ng/ml)处理。组织化学染色:ALP检测盒(美国Sigma公司)按常规指示ALP活性。每3天更换培养基,细胞培养7天后,用PBS磷酸盐缓冲溶液清洗细胞,用混合萘酚AS-BI碱性溶液培养和茜素红染色定性检测钙矿沉积情况。红色不可溶解的颗粒物提示ALP活性的水平；定量分析:培养3天后细胞溶解,细胞ALP活性用荧光检测试剂盒(美国Sigma公司)检测,应用4-硝基苯基磷酸二钠盐(4-nitrophenyl phosphate hexahydrate,PNPP)法依说明书检测。
　　 3.瞬时转染和基因测定:
　　 将C2C12细胞接种在12孔板内,含10％胎牛血清的DMEM培养液培养24小时之后,采用Superfect试剂(Qiagen)并依照其说明分别用1μg的12×SBE-Luc,pCMV-Smad1,pCMV-NFκB(p65)或pCMV-IκBα质粒对细胞进行瞬时转染,DNA总量由添加空白质粒均衡。细胞在无血清培养基中用BMP-2(100 ng/ml)和TNF-α(5 ng/ml)培养48小时后,用pH 7.4的PBS清洗细胞3次,RIPA溶液溶解细胞,其萤光素酶活性用荧光素酶分析系统(Promega,Madison,USA)和Victor2多能计数仪(PE,Waltham,MA)测定。用于监测标准化转染率的β-半乳糖苷酶β-gad通过β-半乳糖苷酶的酶分析系统测定(promega)。
　　 4.实时PCR测定(real-timePCR):
　　 将C2C12细胞接种于12孔板中培养,采用上述细胞培养方法,在培养基中分别或联合加入BMP-2(100 ng/ml)和TNF-α(5 ng/ml)进行培养。48小时后收集细胞进行检测。采用TRIzol提取液(Invitrogen公司)提取总的RNA。应用总RNA逆转录合成cDNA,进行实时定量PCR检测。鼠Smadl特殊上游引物为5-GCTTCGTGAAGGGTTGGG-3’,下 游 引 物 为5`-CGGATGAAATAGGATGTGGGG-3`。反应条件为:50℃ 2分钟,95℃10分钟；然后95℃ 15秒,60℃ 30秒,共40次循环。用ABI Prism公司的7000序列检测系统软件进行结果分析。以GAPDH为内参,通过AACT方法分析基因表达结果。至少重复进行三次单独的实验。
　　 5.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting):
　　 将C2C12细胞接种于12孔板中,用10％胎牛血清培养基中培养24小时,之后用无血清培养基替代,并加入BMP-2(100 ng/ml)和/或TNF-α(5 ng/ml),分别培养1、3、6小时。细胞用RIPA缓冲液溶解。同等数量总细胞溶解产物用磷酸化的Smadl(Scr463/Ser465)抗体及β-肌动蛋白抗体(β-actin)进行SDS-PAGE和Western blotting分析。β-actin作为内参对照。
　　 6.数据统计分析:
　　 采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。计量资料计算均数±标准差((x)±s)表示,多组均数比较采用单向方差分析,多组均数多重比较方差齐性采用SNK法,方差不齐时采用Tamhane's T2法,实时PCR监测Smad1 mRNA表达用重复测量方差分析。检验水准=0.05,以P<0.05为统计学差异有意义。
　　 四、结论
　　 在创伤骨折和类风湿性关节炎中持续性的炎症和感染的存在影响骨再生。其影响机制尚不十分清楚,阻止炎症因子抑制骨再生可能是潜在的治疗方法。实验结果显示,在C2C12细胞中TNF-α能抑制成骨细胞分化,并且TNF-α对BMP-2诱导的成骨细胞分化和其对骨诱导信号的抑制具有量效相关性。此抑制作用可能是通过阻断BMP2-Smad1信号通路而实现的。阶梯实验证实TNF-α-NF-kB信号通路可以抑制BMP2-Smad1信号通路,TNF-α能减弱Smad1活性但并不减少其丰度。本研究首次显示激活的NF-κB是通过降低Smad1的活性进而抑制成骨细胞分化。并首次证明NBD多肽能有效地改善TNF-α对成骨细胞的抑制作用。这就为寻找治疗类风湿性关节炎和创伤骨折感染和其他骨丢失性疾病的新途径提供了新的思路。

目录

文摘

英文文摘

前言

1.研究背景

2.研究方法和技术路线

3.本研究的特色与创新之处

参考文献

第一章 骨折愈合的分子机制与调控研究现状

1.骨折愈合的分子机制

2.成骨细胞中基因的表达

3.Wnt信号通路和成骨细胞分化

4.NF-κB信号途径与成骨细胞分化

5.成骨细胞-破骨细胞串扰作为一个可能的促进骨代谢途径

6.BMP家族生长因子对骨形成的影响

7.炎症细胞因子对骨形成的调控机制

8.NBD多肽的对炎症反应的调节

9.骨形成治疗展望

参考文献

第二章 炎症因子TNF-α对成骨细胞分化的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三章 TNF-α和NF-κB对成骨细胞BMP-2 Smad1信号通路的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第四章 NBD多肽改善TNF-α抑制成骨细胞分化的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第五章 全文总结

攻读学位期间成果

缩略语表

致谢

统计学证明