携带VEGF基因的MSCs对BPD的治疗研究：1.VEGF真核表达载体构建及表达

摘要

支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早产儿常见的慢性肺部疾病,患儿长期氧依赖,重症患儿多因反复感染而死亡,存活者可遗留脑瘫、听力丧失、视力损害等残疾,与儿童哮喘病、慢性阻塞性肺部疾病、肺动脉高压、心力衰竭等的发生也有密切关系,对社会和家庭造成了严重的经济和心理负担。近年来,随着产前激素、肺表面活性物质(PS)制剂的应用和机械通气技术的提高,早产儿整体存活率明显提高。同时由于遗传生殖工程的发展和实施,试管婴儿、多胞胎增加,加之环境因素及其他多种因为,不可避免的早产儿尤其超早产儿明显增多,BPD发病呈现上升趋势。肺泡简单化和肺微血管异常最终导致肺气血交换的功能减弱,是新型BPD发病的核心机制。研究发现,肺部血管新生与肺泡化的进程密切相关,对于死于BPD患儿的尸解发现肺部小血管的密度和数量均明显低于正常新生儿。采血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受体抑制剂SU5416或特殊的抗血管生成药物,可以有效的减少肺部微血管生成,使肺泡化进程受阻,肺泡数和气体交换面积明显减少,呈现与BPD惊人相似的病理特征,这些发现表明血管内皮细胞生长因子与肺部血管的生成和BPD的发病存在密切的关系。
　　 研究表明,利用转基因技术,将血管生成调控因子基因导入目的细胞,使其表达某些调控因子,可有效促进血管生成。
　　 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells.MSCs)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,在不同的诱导条件下可向骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞和内皮细胞等各种细胞系转化,由于骨髓间充质干细胞属未分化的前体干细胞,表型分化尚不成熟,免疫原性小,所以移植后无排斥反应或反应较弱,而且,骨髓间充质干细胞还具有取材方便、体外扩增容易、体外增殖能力强、易于基因操作等独特的优点,逐渐成为基因治疗适宜的细胞载体。VEGF是目前已知的最强的促血管再生因子,近年来应用血管内皮细胞生长因子165基因(VEGF165)转染骨髓间充质干细胞,用于心肌缺血或肢体缺血性疾病的实验及临床研究已取得了令人瞩目的成就,但将其应用于肺损伤的研究尚未见报道,因此,采用基因转移技术将VEGF165基因转入骨髓间充质干细胞中,使其有效表达目的基因和蛋白,植入损伤肺组织后使骨髓间充质干细胞在局部分泌VEGF蛋白,在VEGF基因治疗的同时给予补充血管新生的足够前体细胞,有可能解决单纯VEGF治疗的维持时间短、刺激大和血管结构异常的弊端,从而促进BPD模型肺结构和功能的正常化。
　　 本研究观察新生大鼠BPD动物模型肺组织结构、血管密度及VEGF蛋白表达变化及相关性,分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并构建大鼠VEGF164真核表达载体,采用脂质体介导重组大鼠VEGF164基因转染大鼠骨髓间充质干细胞,观察VEGF164基因mRNA转录、蛋白的表达情况及转染后对骨髓间充质干细胞的影响,为进一步接种转染VEGF164基因的骨髓间充质干细胞于新生大鼠BPD动物模型奠定基础,观察其在BPD模型肺组织结构和功能重建中的作用和转归,为BPD的临床治疗探索新的途径。
　　 基于这种认识,我们开展了以下一系列研究:
　　 第一部分 高氧致新生鼠肺结构及VEGF的变化及相关分析
　　 目的:探讨新生大鼠高氧肺损伤后肺组织结构,血管密度及VEGF蛋白的表达变化及相关性。
　　 方法:新生Sprague-Dawley大鼠72只随机分为高氧实验组和空气对照组,高氧组吸入95％高氧建立高氧肺损伤模型。分别采用HE染色和免疫组化法观察新生大鼠3d、7d、14d肺组织形态改变并作肺泡辐射状记数(radial alveolar countsRAC),检测Ⅷ因子及VEGF蛋白表达。
　　 结果:对照组大鼠生后随着肺发育,肺泡化逐渐完善,RAC计数、VEGF蛋白及Ⅷ因子表达逐渐增加。高氧组随着吸氧时间延长RAC计数、肺组织VEGF蛋白及Ⅷ因子表达均出现降低,并出现肺泡化阻滞,VEGF与Ⅷ因子始终具有相关性。
　　 结论:VEGF促进新生大鼠肺发育,新生大鼠高氧可抑制VEGF及Ⅷ因子在鼠肺内的表达,致肺泡化阻滞,出现类似早产儿支气管肺发育不良的肺组织形态学特征,VEGF在新生鼠肺发育和高氧肺损伤机制中起重要作用。
　　 第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定
　　 目的:建立一种分离纯化和培养大鼠骨髓间充质干细胞的方法,为利用骨髓间充质干细胞进行基因治疗提供实验基础。
　　 方法:密度梯度离心和贴壁培养相结合,分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞。倒置相差显微镜下观察大鼠骨髓间充质干细胞形态学变化；流式细胞仪检测大鼠骨髓间质干细胞的表面标记。
　　 结果:密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的大鼠骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检测大鼠骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD34、CD45阳性表达细胞比率分别为98.9％、98.7％、0.0％、0.3％。
　　 结论:采用密度梯度离心和贴壁培养相结合,可获得纯度较高和活性骨髓MSC,是简便有效实用可行的方法。
　　 第三部分 大鼠pcDNA3.1(一)/VEGF164真核表达载体的构建及鉴定
　　 目的:构建大鼠血管内皮细胞生长因子 164(VEGF164)真核表达载体pcDNA3.1(一)/VEGF164,并检测其序列及片段大小,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。
　　 方法:应用Trizol总RNA提取试剂盒,按照其要求步骤,从大鼠血管组织中提取总RNA,根据GENEBANK设计大鼠基因片段VEGF164引物,上游引物为:5’GACGGATCCATGAACTTTCTGCTCTCTTGGGTGC 3’,下游引物为:5’TGAAAGCTTTCACCGCCTTGGCTTGTCAC 3’,片段长度为645bp,逆转录制备cDNA,聚合酶链反应扩增产物,将产物行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收,分别将质粒和pcDNA3.1(一)载体以BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切,用T4 DNA连接酶进行连接,取连接产物转化至感受态细胞DH5 α,经过菌落PER,BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切基因测序,并以无内毒素质粒提取试剂盒提取重组质粒。
　　 结果:通过RT-PCR从大鼠血管组织中扩增出645bp大小的目的片段,重组质粒转化大肠杆菌后经菌落PCR同样扩增出645bp大小的目的片段,BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切重组质粒pcDNA3.1(一)/VEGF164均能切出两条相应目的条带,测序后与基因库(Genbank)中序列VEGF164的cDNA进行对比,证明完全一致。
　　 结论:成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体。
　　 第四部分 VEGF164在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染和表达
　　 目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞转染VEGF164基因后外源基因及其蛋白的表达。
　　 方法:采用脂质体介导pcDNA3.1(一)/VEGF164转染大鼠骨髓间充质干细胞,并设立空质粒对照组(转染pcDNA3.1空载体)、脂质体对照组(转脂质体),用RT-PCR、ELISA和细胞免疫组化检测大鼠骨髓间充质干细胞VEGF164mRNA及其蛋白的表达情况。
　　 结果:RT-PCR检测到瞬时转染后的细胞有VEGFmRNA表达。ELISA检测质粒转染组、空质粒对照组和脂质体对照组处理后72h细胞上清VEGF的浓度分别为272.11±5.39pg/ml、78.29±2.03pg/ml、81.19±1.60pg/ml,质粒转染实验组与其他对照组相比具有显著差异(P<0.01),质粒转染后第5天表达达到最高,以后再逐渐降低。细胞免疫组化显示质粒转染组骨髓间充质干细胞可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。
　　 结论:实现VEGF164基因对大鼠骨髓间充质干细胞的成功转染,并有效表达目的基因及其蛋白,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

研究背景

参考文献

第一部分 高氧致新生鼠肺结构及VEGF的变化及相关分析

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三部分 大鼠PCDNA3.1(-)/VEGF164真核表达载体的 构建及鉴定

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四部分 血管内皮细胞生长因子基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染和表达

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

在读期间论文发表情况

致谢

论文统计合格证明