可注射水凝胶携带Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC移植治疗大鼠心肌梗死及其机制研究

摘要

骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)移植治疗心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)极有发展前景，但临床试验结果显示治疗效果微弱，移植细胞在缺血心肌极低的滞留率和存活率是主要原因之一。对MSC进行基因修饰或使用生物材料来承载后移植可改善这一问题。Bcl-2(B-cell lymphoma2，Bcl-2)基因能抑制细胞凋亡。VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)基因能促血管生成。可注射水凝胶(Injectable Hydrogel，IH)具有可注射性、生物降解性和组织细胞相容性，能承载细胞进行移植。
　　目的:
　　使用IH联合Bcl-2和VEGF双基因修饰拟提高MSC移植对MI的疗效，为临床使用提供实验基础及理论依据。
　　方法和结果:
　　1、PCR扩增获取Bcl-2和VEGF基因并使用T2A序列连接以实现双基因的共表达。构建能同时携带Bcl-2和VEGF基因的慢病毒载体并筛选构建能稳定过表达Bcl-2和VEGF基因的SD大鼠MSC。荧光定量PCR和Western blot结果证实Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC对比Bcl-2或VEGF单基因表达MSC对Bcl-2和VEGF基因有更高的表达。CCK-8结果说明Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC对比Bcl-2或VEGF单基因表达MSC增殖更快。
　　2、体外糖氧剥夺（Oxygen and Glucose Deprivation，OGD）模型模拟体内缺血缺氧微环境，实验分为五组:MSC-GFP组、MSC-VEGF组、MSC-Bcl-2组、MSC-BV组、MSC-GFP正常培养组。AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术和Westernblot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3，结果表明OGD诱发了MSC的凋亡，Bcl-2或VEGF单基因修饰的MSC凋亡减少，Bcl-2和VEGF双基因修饰的MSC-BV较Bcl-2或VEGF单基因修饰的MSC凋亡减少更显著。ELISA结果显示Bcl-2和VEGF双基因修饰能增强OGD环境下MSC旁分泌VEGF，bFGF，HGF和IGF-1。
　　3、IH携带Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC进行对MI大鼠的移植治疗，实验分为六组:SHAM组、PBS组、IH组、MSC组、MSC+BV组、MSC+BV+IH组。细胞移植治疗4周后心脏超声结果提示MSC+BV+IH组的心脏收缩功能改善更显著。HE和Masson染色结果提示MSC+BV+IH组的梗死面积显著缩小。cTnT免疫荧光结果提示MSC+BV+IH组心肌存活更多。TUNEL和Western blot结果提示MSC+BV+IH组心肌细胞凋亡减少更显著。vWF和a-SMA免疫荧光结果提示MSC+BV+IH组血管密度更高。CM-Dil标记MSC移植提示MSC+BV+IH组的细胞滞留改善更明显。
　　4、原代培养SD乳鼠心肌细胞，与MSC使用Transwell共培养系统置于1％O2缺氧处理24h，实验分为四组:心肌细胞正常培养组、心肌细胞缺氧组、心肌细胞+MSC+GFP缺氧组、心肌细胞+MSC+BV缺氧组。采用AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术、Western blot检测凋亡蛋白Cleaved-capase-3、TUNEL分析心肌细胞凋亡，结果表明与Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC共培养更能减少缺氧状态下心肌细胞的凋亡。
　　结论:
　　1、成功构建了Bcl-2和VEGF双基因共表达重组慢病毒载体;筛选构建了Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC;对比Bcl-2或VEGF单基因表达MSC，其对目的基因Bcl-2和VEGF有更高的表达，更快的增殖速度。
　　2、Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC对比Bcl-2或VEGF单基因表达MSC在体外糖氧剥夺环境下发挥更好的自我保护和旁分泌作用。
　　3、Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC移植对心肌梗死有更好的治疗作用，可注射水凝胶的承载移植进一步增强了MSC的治疗作用。
　　4、Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC体外通过旁分泌作用保护缺氧心肌细胞。

目录

摘要

前言

第一部分 Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC的构建

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分 Bcl-2和VEGF双基因修饰增强MSC在糖氧剥夺环境下的自我保护和旁分泌作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三部分 可注射水凝胶携带Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC移植治疗大鼠心肌梗死

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第四部分 Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC通过旁分泌作用保护缺氧心肌细胞

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

全文结论

参考文献

综述 改善间充质干细胞移植对缺血性心脏病治疗效果的策略

中英文缩略词对照表

攻读学位期间成果

致谢

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