失神经再支配后环杓后肌电生理及组织学特性的研究

摘要

研究背景及意义:
　　 声带麻痹是临床上常见的问题,它有很多因为,最主要的因为是由于喉返神经受到损伤而导致。在过去的几十年里,治疗声带麻痹一直是学者们感兴趣的研究内容,但是至今为止,仍然没有一种令人满意的治疗方法。理想的治疗效果是恢复声带的生理性的运动功能。目前治疗声带麻痹有很多方法,包括声带注射脂肪或注射胶原等注射术,甲状软骨成形术和杓状软骨内转术,此外,大多数学者认为喉返神经再支配是最有前景的方法,它可以恢复正常的声音,并恢复喉的其他一些重要的功能。这些方法或多或少都有一定的效果,但都存在不足之处。
　　 哺乳动物的喉肌是高度分化的器官,有着特殊的功能,比如控制呼吸,保护气道和发声等。肌球蛋白是肌肉中含量最丰富的收缩蛋白,肌球蛋白的亚型决定了ATP酶的活性、最大收缩速度和最大力量。所以肌球蛋白被认为是代表肌纤维功能特性最佳的指标。肌球蛋白分了由2个肌球蛋白重链(MyHC)和4个肌球蛋白轻链(MyLC)组成。ATP酶的活性和运动功能主要局限在肌球蛋白的MyHC亚基上面。喉肌在神经再支配后,MyHC发生了怎样的变化,以及这些变化和它们控制喉肌功能之间的关系尚不清楚。我们的研究就是为了明确喉肌失神经再支配后电生理特性的变化和MyHC亚型表达的变化,探索喉肌失神经再支配后MyHC亚型表达的变化规律,从而为临床上治疗喉肌失神经后功能的恢复提供理论基础和研究方向。本研究包括以下两部分:
　　 第一章 双侧颈袢神经再支配环杓后肌电生理特性研究
　　 目的:
　　 将颈袢神经近心端同喉返神经远心端吻合常常使用在重建喉肌功能的手术中,吻合后环杓后肌的电生理特性可能发生改变,我们为研究环杓后肌失神经再支配后的电生理变化而做此研究。
　　 对象与方法:
　　 1.成年家犬购于广东省人民医院-广东省医学科学院动物研究中心,总共14只。随机分为实验组和对照组。实验组7只家犬全麻下手术暴露双侧喉返神经后,将其切断,立即将颈袢神经近心端与喉返神经远心端相吻合,饲养9周；正常对照组7只家犬切开皮肤,同样暴露并游离出双侧喉返神经,不切断喉返神经,缝合切口,饲养9周。
　　 2.9周后,实验组家犬伞麻下手术暴露神经吻合处,采用功能性电刺激刺激环杓后肌,并记录对应的声门开大移动最大值、声门开最大电刺激电压阈值和声门开大声带移动电压阈值。正常对照组同样测量这三个值。
　　 3.实验数据用SPSS13.0统计软件进行统计学处理分析。所得计量资料以均数±标准差表示,两组结果比较用独立样本t检验(Independent Samples TTest),P<0.05为差异有显著性。
　　 结果:
　　 1.实验组的声门开大移动最大值是(3.0±0.8)mm,正常组的声门开大移动最大值是(3.8±1.1)mm。t=-1.506,P=0.158。实验组和正常对照组比较无统计学差异。
　　 2.实验组的声门开最大电刺激电压阈值是(4.86±1.46)V,正常组的声门开最大电刺激电压阈值是(3.36±1.25)V。t=2.063,P=0.061。实验组和正常对照组比较无统计学差异。
　　 3.实验组的声门开大声带移动阈值是(0.46±0.15)V,正常组的声门开大声带移动阈值是(0.39±0.21)V。t=0.736,P=0.476。实验组和正常对照组比较无统计学差异。
　　 结论:
　　 我们的研究发现,吻合组使用同正常组相近的电压刺激环杓后肌就可以产生声带移动,声带最大外展时两组的刺激电压大小也相近,提示了吻合后的神经在其电生理特性上接近于正常。说明了利用颈袢神经近心端吻合喉返神经远心端9周后动物的环杓后肌对电刺激的敏感性同正常的环杓后肌非常接近。尽管神经吻合后不能恢复环杓后肌的主动外展,但是通过木实验发现,使用颈袢神经吻合喉返神经远端,可以重建并恢复环杓后肌的电生理功能,使环杓后肌的电生理状态在失神经再支配后几乎维持在接近正常的状态,这样就可以防止失神经肌肉萎缩及肌纤维化,进而使用较小的电刺激就能够促使颈袢神经重建的环杓后肌发生收缩,从而达到开大声门的目的。说明了环杓后肌失神经后,用颈袢吻合喉返神经9周后,可以防止肌萎缩,促使声带运动等喉肌功能的恢复,这为进一步的喉起搏器的改进提供了电生理学的基础。
　　 第二章 双侧颈袢神经再支配环杓后肌组织化学特性研究
　　 目的及意义:
　　 1.检测环杓后肌中肌球重链蛋白(MyHC)亚型及胶原纤维在mRNA水平的表达。
　　 2.比较环杓后肌失神经及再支配后肌球重链蛋白各个亚型及胶原纤维在mRNA水平的表达所发生的变化。
　　 材料和方法:
　　 1.标本的获取:成年家犬购于广东省人民医院-广东省医学科学院动物研究中心,总共24只。随机分为切断组、吻合组和正常对照组。切断组8只家犬全麻下手术暴露双侧喉返神经后,将其切断,并将近心端反折结扎,饲养9周；吻合组8只家犬全麻下手术暴露双侧喉返神经后,将其切断,立即将颈袢神经近心端与喉返神经远心端相吻合,饲养9周;正常对照组8只家犬同样全麻下手术切开皮肤,暴露并游离出双侧喉返神经,不切断喉返神经,缝合切口,饲养9周。
　　 9周后,切断组、吻合组及正常对照组家犬均在全麻下取左侧环杓后肌标本,供提取RNA用。
　　 2.提取切断组、吻合组及正常对照组肌肉标本的总RNA,然后对总RNA进行逆转录,用Real-time PCR方法对3组肌肉标本中的各型肌纤维及胶原纤维mRNA的表达量进行定量分析,并比较3组环杓后肌标木中各型MyHC亚型和胶原纤维表达的差异。
　　 3.对Real-time PCR产物用琼脂糖电泳技术进行检测,验证3组动物的环杓后肌中各MyHC亚型和胶原纤维的表达。
　　 4.采用SPSS13.0软件分析,所有计量资料以(x)±S表示,组间差异采用单因素方差分析,P值<0.05作为显著性差异的界限。组间多重比较用LSD法,P值<0.05作为显著性差异的界限。
　　 结果:
　　 1.正常对照组和吻合组中均有一只家犬因术后感染而死亡。
　　 2.切断组、吻合组及正常对照组三组动物的环杓后肌中均检测到以下6种MyHC亚型的mRNA表达:Ⅰ,ⅡA,ⅡB,ⅡX,Neonatal及Collagen Ⅰ。
　　 3.切断组、吻合组及正常对照组三组动物的环杓后肌中均没有EO型MyHC的表达。
　　 4.正常组(n=7)中Ⅰ、ⅡA、ⅡB、ⅡX、Neonatal、Collagen Ⅰ型MyHC基因的表达量(()X±S)分别为:0.36±0.36,0.01±0.27,-2.69±0.55,0.34±0.81,-2.06±0.40,-1.31±0.66；切断组(n=8)中Ⅰ、ⅡA、ⅡB、ⅡX、Neonatal、Collagen Ⅰ型MyHC基因的表达量((x)±S)分别为:0.88±0.26,0.54±0.26,-2.71±0.52,-0.04±0.64,-0.38±0.32,-0.90±0.63;吻合组(n=7)中Ⅰ、ⅡA、ⅡB、ⅡX、Neonatal、Collagen Ⅰ型MyHC基因的表达量((x)±S)分别为:0.26±0.29,-0.08±0.93,-3.40±1.03,-0.93±0.86,-1.61±0.60,-1.72±0.68。
　　 5.Ⅰ、ⅡX和Neonatal型MyHC在正常组、切断组及吻合组间的表达比较有统计学差异,P值分别为0.002,0.017和0.000;而ⅡA、ⅡB和CollagenⅠ型MyHC在正常组、切断组及吻合组间的表达比较无统计学差异,P值分别为0.094,0.138,0.079。
　　 结论:
　　 1.家犬的环杓后肌中含有Ⅰ型、ⅡA型、ⅡB型、ⅡX型、Neonatal型MyHC及Collagen Ⅰ型MyHC,没有EO型MyHC的表达。
　　 2.家犬的环杓后肌失神经9周后,Ⅰ型MyHC和Neonatal型MyHC在mRNA水平表达量增高,而用颈袢神经再支配9周后,Ⅰ型MyHC和Neonatal型MyHC在mRNA的水平恢复至正常水平。提示喉肌功能的部分恢复,说明了喉肌有一定的可塑性。
　　 3.我们的结果提示:为了适应整个身体器官的移动并对身体提供一些特殊的功能,肌肉必须拥有一定的可塑性,以应对不断变化的环境。每一块肌肉都由不同特性的肌纤维组成,使得每一块肌肉都可以拥有自己独特的功能,满足自身的生理需求。我们研究环杓后肌肌纤维在失神经及再支配后各型MyHC的变化规律,探索肌肉如何适应不断变化的环境而发生适应性的功能变化,可以为治疗喉返神经损伤或麻痹的患者重建喉功能、发现一些新的治疗疾病的方法、提高患者生活质量提供理论基础和研究方向。

目录

文摘

英文文摘

前言

参考文献

第一章 双侧颈袢神经再支配环杓后肌电生理特性研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 参考文献

第二章 双侧颈袢神经再支配环杓后肌组织化学特性研究

1 材料与方法

2 结果

3 结论

4 讨论

5 参考文献

全文小结

附录：缩略词对照表

致谢

统计学证明