苦豆子总碱治疗葡聚糖硫酸钠致急性期溃疡性结肠炎小鼠作用机制研究

摘要

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因未明的非特异性肠道炎症件病变,以腹泻、腹痛、里急后重和粘液脓血便等为主要症状。世界范围内,UC的发病率波动在0.5-24.5/105,近年来我国的发病率已达到11.6/105,并逐年上升。UC病理变化很复杂,按其发生、发展过程及内镜下表现,分为急性期和慢性期。UC急件期(活动期)发作,若得到控制,其症状缓解并治愈,若失治误治,炎症反复发作,则转变成慢性,其中有5-10％的UC患者易发生癌变,而病程在25年以上者癌变率高达40％。因此,急性期UC的治疗对于防止其慢性化及癌变有重要意义,但临床上至今没有特异性根治措施。所以UC已被世界卫生组织列为现代难治病之一。
　　 中药苦豆子(Sophora alopecuroides,L)为豆科槐属植物,民间广泛用于治疗肠炎腹泻。本课题组前期研究发现苦豆子总生物碱(total alkaloids of Sophoraalopecuroides,TASA)是苦豆子治疗UC的主要活性部位(已取得国家专利“苦豆子总生物碱在制备治疗UC药物中的应用及结肠靶向制剂的制备方法”(ZL200410052029.0),拥有自主知识产权)。初步临床研究表明TASA治疗UC的总有效率达67.2％。动物实验发现,TASA能显著改善三硝基苯磺酸(TNBS)和葡聚糖硫酸钠(DSS)致慢性UC的模型动物便血等一般体征,抑制体重下降,缓解结肠粘膜炎症；能够使免疫抑制小鼠体重增加,胸腺指数、脾脏指数增加；初步研究其作用机制可能通过调节炎症因了CD4＋CD25＋、CD8＋CD28-Tregs比例、IL-10、ICAM-1、MIF、TFF3等实现。但前期研究主要局限在慢性UC上,对急性或慢性急性发作的活动性UC未进行深入研究。
　　 目前,肠粘膜免疫功能紊乱介导的促炎细胞因了与抗炎细胞因子之间的平衡失调在UC中的作用日益受到重视。肠粘膜免疫功能异常,肠粘膜发生炎症,肠粘膜固有层单个核细胞(LPMC)异常激活,产生大量炎性细胞因了(如IL-1β、IL-6、TNF-a等),而抗炎细胞因子(如IL-4、IL-10)等表达减少,细胞因子网络失衡,炎症持续发展。细胞因了进一步激活炎症细胞内的炎症信号分子(如NF-kB和STAT等),启动并调节炎症因子的表达。IL-6/JAK/STAT是近年来研究比较多的一条信号通路,它与多种细胞因子、生长因子的信号转导有关,可以调控人体炎症反应、免疫反应以及细胞的生长、分化等。已有研究表明UC患者肠黏膜STAT3表达增加且活化增强,但其具体作用机制未明。
　　 目的:探讨TASA对葡聚糖硫酸钠(dextran Sulfate sodium,DSS)诱导的小鼠急性期UC的治疗作用及其对细胞因子IL-1β、IL-4和IL-6的影响,检测UC小鼠肠黏膜STAT3的表达和活化水平,同时检测IL-6的表达,探讨IL-6/STAT3信号通路在UC发病中的调节机制及TASA对该通路的影响。
　　 方法:60只C57BL/6小鼠随机分为正常组(Control),模型组(DSS),柳氮磺嘧啶(SASP:520 mg-kg-1),TASA高、中、低剂量组(TAH、TAM、TAL:80、40、20 mg-kg-1)。Control组饮用蒸馏水。DSS组和治疗组自由饮用5％DSS7 d以产生急性期UC模型,造模同时治疗组灌服相应药物。Control组和DSS组灌服等体积生理盐水。每日观察小鼠进食、饮水、活动、毛色等一般情况,称量体重,观察粪便性状、大便隐血及便血情况,进行疾病活动指数评分(DAI),观察小鼠结肠粘膜的大体形态和组织病理学变化,行组织学评分；通过酶联免疫吸附法(ELISA)观察TASA对急性期UC小鼠血清细胞因子IL-1β、IL-4和IL-6表达的影响；用免疫组织化学法和Western blotting法检测各组结肠粘膜IL-6、STAT3和p-STAT3蛋白的定位分布及表达。
　　 结论:1.TASA对DSS诱导的急性期UC有一定治疗作用,可有效减轻其腹泻、便血、体重下降等症状,使肠粘膜组织炎症好转,减轻其DAI评分和组织学评分。2.DSS诱导的急性期UC小鼠肠粘膜存在着促炎因子升高,抗炎因子表达降低等细胞因子表达失衡的状况,TASA可显著降低促炎因子lL-1β和IL-6的表达,升高抗炎因子IL-4水平,调节细胞因子网络平衡,促进肠粘膜的炎症恢复。3.DSS急性期UC小鼠肠黏膜中IL-6、STAT3、p-STAT3表达增加,活化增强；且以p-STAT3核内的增加量最为显著,说明STAT3在UC急性期被上游因子IL-6活化而磷酸化移位至细胞核,而给予TASA治疗后IL-6、STAT3、p-S’TAT3表达量减少,尤以p-STAT3表达量减少最多,推测STAT3蛋白可能是通过IL-6/STAT3途径参与UC的发病过程,而TASA可能通过抑制IL-6/STAT3信号通路,减少IL-1β和IL-6等下游促炎因子的表达,调节细胞因子网络平衡,来减轻小鼠肠粘膜炎症损伤。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分 TASA对小鼠急性溃疡性结肠炎的治疗作用

引言

材料

实验方法

实验结果

讨论

第二部分 TASA对急性期溃疡性结肠炎血清细胞因子的影响

研究对象

实验试剂

实验仪器

实验方法

实验结果

讨论

第三部分 TASA对急性期UC小鼠IL-6/JAK/STAT3信号转导通路的影响

研究对象

实验试剂

实验仪器

溶液配制

实验方法

实验结果

讨论

结论

全文小结

参考文献

英文缩略词表

攻读硕士学位期间成果

致谢

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