尘螨、过氧化氢对人支气管上皮细胞表达血管内皮生长因子的影响及机制研究

摘要

支气管哮喘(简称哮喘)是一种严重影响人类健康的慢性呼吸道疾病。研究显示,全球哮喘病人约3亿,我国约有3000万哮喘患者,而且有不断增加的趋势。哮喘是基因与环境因素共同导致的复杂疾病,尽管经由GINA推荐的规范化治疗方案可以让大部分患者得到有效控制,但依然不能改变哮喘的自然病史。同时全球哮喘的规范化治疗及哮喘控制率距GINA的目标还相差甚远。我国的哮喘诊治率非常不乐观,加上现有的哮喘治疗药物价格偏高,很多患者无法承受巨大的医疗支出,这也使得哮喘的规范化治疗陷入了困境,同时目前对哮喘确切的致病机制仍然不清楚,因此探讨哮喘发病机制、寻找新的治疗靶点仍然是呼吸专业关注的重要课题。
　　 气道上皮细胞(AEC),作为气道抵抗外来刺激的第一道防线,在固有免疫中发挥着重要的作用。近年来也证实,AEC是哮喘固有免疫与获得性免疫联系的桥梁,在多种哮喘触发因素作用下,AEC释放多种炎性介质,与免疫、炎性细胞及气道结构细胞发生广泛的联系,参与哮喘的发生、发展。现在认为:AEC在哮喘气道炎症的启动和维持中扮演关键角色。
　　 哮喘中存在着免疫失衡,多种细胞因子参与了其发生、发展。因此,探讨引发炎症失衡的关键细胞因子会给哮喘的防治带来新的曙光。有研究通过转基因动物实验表明,阻断血管内皮生长因子(VEGF),能使哮喘的气道炎症、气道重塑、气道高反应件等病理生理变化趋于正常化。本课题组前期研究已经证实VEGF在职业相关因素甲苯二异氰酸盐(TDI)诱导AEC通透性的调节中发挥重要作用。上述均提示VEGF可能成为哮喘防治的重要靶点。
　　 哮喘的触发因素很多,尘螨是自然界导致哮喘发生的最常见的致敏原,而且有动物实验也证实利用尘螨刺激能够成功建立哮喘动物模型。但是尘螨导致哮喘的发生、发展的确切机制目前仍不明确,需要深入探讨。
　　 研究已经证实哮喘存在氧化还原的失衡,氧化应激与哮喘发生、发展密切相关,涉及哮喘自然病史、气道炎症、气道高反应性但机制仍不清楚。因此,探讨哮喘中的氧化应激机制有可能为哮喘的防治提供新的靶点。
　　 鉴于尘螨及氧化应激在哮喘发病中的重要的作用,本实验将在前期研究基础上选择VEGF为主要检测指标,利用体外AEC研究模型,探讨尘螨、过氧化氢刺激下HBE表达VEGF的影响及机制,试图为哮喘的发病机制及治疗靶点提供新的实验依据。
　　 课题第一部分:标准化屋尘螨制剂(安脱达(R)SQ)对人支气管上皮细胞(16-HBE)表达血管内皮生长(VEGF)的影响及可能机制
　　 方法:
　　 1、购买标准化尘螨制剂(安脱达(R)SQ)。
　　 2、四唑盐(MTT)比色法检测不同标准化尘螨制剂(以下简称尘螨)浓度对16-HBE活力的影响,分组情况:正常对照组,尘螨100U/L组,尘螨200U/L组,尘螨400U/L组,尘螨600U/L组,尘螨800U/L组,尘螨1000U/L组,尘螨2000U/L组。
　　 3、观察不同浓度尘螨对16-HBE VEGF基因表达的影响,分组情况:正常对照组,尘螨200U/L组,尘螨400U/L组,尘螨600U/L组,尘螨800U/L组,尘螨1000U/L组。按上述刺激24h后,收集细胞培养上清,并提取总RNA,应用Real time-PCR检测16-HBE的VEGF基因表达情况。
　　 4、选取对VEGF升高最明显的尘螨浓度400U/L,预先加入PI3K特异阻断剂LY294002处理45min,浓度为10μmol/L,并设单独加入LY294002(10μmol/L)组,上述刺激24h后收集细胞培养上清,并提取总RNA,应用Real time-PCR检测16-HBE的VEGF基因表达情况。
　　 5、应用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测上述细胞培养上清中VEGF蛋白表达情况。
　　 6、统计学方法:采用SPSS13.0统计软件分析,计量资料用均数±标准差表示,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用LSD法,方差不齐时总体均数的比较采用Welkch法,各组间多重比较采用Dunnett’s T3法检验,以P<0.05具有统计学意义。
　　 结论:标准化尘螨制剂在不影响细胞活力的情况下,在一定浓度范围内能够在基因和蛋白水平上调16-HBE VEGF(165)的表达,以400U/L浓度时最显著,且能够被PI3K通路特异阻断剂LY294002所抑制。提示标准化尘螨制剂可PI3K通路依赖地上调16-HBE VEGF基因和蛋白的表达。
　　 第二部分:过氧化氢对人支气管上皮细胞表达VEGF的影响及可能机制
　　 方法:
　　 1、观察不同浓度的过氧化氢(H2O2)对正常人支气管上皮细胞16-HBE细胞活力影响:分组如下:正常对照组、H2O2(10μmol/L)组、H2O2(50μmol/L)组、H2O2(100μmol/L)组、H2OO2(200μmol/L)组、H2O2(300μmol/L)组、H2O2(400μmol/L)组、H2O2(500μmol/L),按上述分组刺激16-HBE 12小时后,用MTT比色法检测细胞活力。
　　 2、观察不同浓度H2O2及PI3K通路特异性阻断剂LY294002对16-HBE表达VEGF基因的影响:实验分成7组:正常对照组、H2O2(50μmol/L)组、H2O2(100μmol/L)组、H2O2(150μmol/L)组、H2O2(200μmol/L)组、H2O2(100μmol/L)+LY294002(10μmol/L)组、LY294002(10μmol/L)组。按上述分组刺激16-HBE 12小时后,收集细胞上清并提取细胞总RNA,应用Real time-PCR检测16-HBE的VEGF基因表达情况。
　　 3、观察不同浓度的N-乙酰半胱氨酸(NAC)对正常人支气管上皮细胞16-HBE细胞活力影响:分组如下:正常对照组、NAC(10mmol/L)组、NAC(20mmol/L)组、NAC(50mmol/L)组,按上述分组刺激16-HBE12小时后,用四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力。
　　 4、观察不同浓度NAC作用下H2O2(100umol/L)对16-HBE表达VEGF基因的影响:实验分为8组:正常对照组、NAC(10mmol/L)组、NAC(20mmol/L)组、NAC(50mmol/L)组、H2O2(100μmol/L)组、H2O2(100μmol/L)+NAC(10mmol/L)、H2O2(100μmol/L)+NAC(20mmol/L)组、H2O2(100μmol/L)+NAC(50mmol/L)组,按上述分组刺激16-HBE12小时后,收集细胞上清并提取细胞总RNA,应用Real time-PCR检测16-HBE的VEGF基因表达情况。
　　 5、应用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测上述细胞培养上清中VEGF蛋白表达情况。
　　 6、统计学方法:采用SPSS13.0统计软件分析,计量资料用均数士标准差(X±S)表示,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-wayANOVA),各组间多重比较采用LSD法,方差不齐时总体均数的比较采用Welkch法,各组间多重比较采用Dunnett’s T3法检验。以P<0.05具有统计学意义。
　　 结论:
　　 过氧化氢(H2O2)在不影响细胞活力的情况下,在一定浓度范围内能在基因和蛋白水平上调16-HBE VEGF(165)的表达,以H2O2(100μmol/L)时最显著,且能够被PI3K通路特异阻断剂LY294002所抑制,过氧化氢可经由PI3K通路上调16-HBE VEGF的表达。NAC在不影响细胞活力的情况下能够逆转由过氧化氢导致的16-HBEVEGF基因和蛋白水平的表达上调。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分 :标准化尘螨制剂(安脱达(R)SQ)对人支气管上皮细胞(16-HBE)表达血管内皮生长(VEGF)的影响及可能机制

引言

材料方法

结果

讨论

第二部分 过氧化氢(H2O2)对人支气管上皮细胞(HBE)表达血管内皮生长(VEGF)的影响及可能机制

引言

材料方法

结果

讨论

全文小结

参考文献

中英文缩略词对照表

攻读硕士期间主要成果

致谢

统计学证明