城市河流沉积物中超广谱-β-内酰胺酶耐药多样性研究

摘要

临床抗生素耐药性的迅速上升是当前人类面临的重要公共卫生问题之一。近年来,环境(尤其是水环境)中抗生素耐药细菌的普遍污染引起了人们的广泛关注。环境耐药菌的上升主要因人类活动产生,例如医院、市政、水产养殖等废水的排放。环境耐药菌可以通过饮用水、水产品以及直接接触等途径感染人类；并且,这些耐药菌还可以通过基因水平转移将其携带的耐药基因传播给敏感性病原菌,从而产生环境健康风险。
　　 环境耐药菌的研究对象主要包括两大要素,一为靶地点,二为靶物种。目前,人们在水环境猪中研究的靶地点通常为沿流域采集水样,靶物种常为少数特定种属(如肠杆菌),即调研水样中耐药菌物种丰度及其耐药基因。但是,对水环境中物种丰度最高的沉积物样品研究较少,对同一地点不同种属耐药菌及其耐药基因的多样性研究也不足。
　　 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是可水解三代头抱菌素和单环β-内酰胺类抗生素的一大类β-内酰胺酶,主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产生。产ESBLs肠杆菌是当前临床最常见的多耐药菌之一,其在医院环境和社区环境都有较高的发病率。人们已经从水体环境中发现产ESBLs菌,但关于它们在水体沉积物中多样性的研究至今尚未见报道。因此,为了进一步掌握水体环境产ESBLs细菌的耐药机制以及种群特征,木文以城市河流沉积物作为靶对象,研究其产ESBLs细菌及ESBLs基因的多样性。同时,本文还应用基于16S rDNA的T-RFLP技术,分析城市河流沉积物微生物群落结构在头孢噻肟作用下的多样性变化,为抗生素对环境微生物生态的影响提供信息。
　　 目的
　　 阐明广州某受医院废水污染的城市河流沉积物中ESBLs菌及耐药基因的多样性；并研究该沉积物中细菌群落结构在不同浓度头孢噻肟作用下多样性变化情况。
　　 方法
　　 1、本文的沉积物样品采自广州京溪河段,距某大型三甲医院下游约1公里处。采用培养和非培养方法来研究ESBLs的耐药机制多样性情况。为了尽可能地分离出多种类型细菌,我们选用了多种培养基,包括NA、NA稀释10倍的培养基(NA10-1)、EMB、SS、TCBS、PIA、AMB、EA和R2A:在初筛阶段,本研究在培养基找哦陪你过分别添加β-内酰胺类抗生素氨苄西林(30 mg L-1)或头孢噻肟(60mg L-1),以减少因抗生素类型产生的偏倚误差。采用平板涂布法分离细菌后,在加有抗生素的培养基平板上,根据细菌的生长形态随机挑取200-300株耐药菌进行分离纯化,并进一步进行ESBLs表型检测和细菌鉴定。耐药菌的ESBLs表型检测经三步:(1)采用CLSI推荐的产ESBLs细菌表型初筛实验；(2)CLSI表型确证实验；(3)采用PHOENIX-100全自动鉴定/药敏系统测定MIC值,对筛选出的产超广谱β-内酰胺酶菌株进行再次确证。产ESBLs菌株通过PHOENIX-100全自动鉴定/药敏系统的生化鉴定和16S rDNA测序鉴定菌株细菌类型。另外,根据PHOENIX-100全自动鉴定/药敏系统测定的常见抗生素对应的MIC值,观察这些产ESBLs菌株的多重耐药情况。同时,通过聚合酶链式反应(PCR)技术研究产ESBLs菌株的ESBLs基因类型,包括blaTEM、blaSHV、blaIMP、blaOXA和blaCTX-M。本文还采用Ultraclean Soil DNA试剂盒提取沉积物的总DNA,并结合TA克降文库测序法,从非培养角度分析该沉积物微生物CTX-M型ESBLs基因的多样性。
　　 2、本文研究细菌群落结构多样性变化所用的沉积物样品同上,分别称取30g该沉积物样品在0 mg L-1、6.4 mg L-1、64 mg L-1和320 mg L-1的头孢噻肟作用0d、3d、7d、14d和21d,然后在不同的采样时间分别称取2g各处理组的所有样品；采用基于SDS的直接提取土壤总DNA的方法提取各样品的总DNA；最后应用基于16S rDNA的T-RFLP技术,收集T-RFLP图谱上得到的片段大小、峰面积以及峰高信息、结合采样时间或抗生素浓度,对细菌群落结构多样性变化进行统计分析；然后用多样性系数统计公式计算OUT数、物种丰度、多样性指数(Shannon-Weiner指数)和物种均度,并结合SPSS统计软件对不同时间点的细菌群落结构多样性信息进行ANOVA统计分析；同时,通过巢式PCR,分析不同时间点耐药基因blaCTX-M的多样件变化。
　　 结果
　　 1、耐药菌株分离及其ESBLs表型的检测:根据在加有β内酰胺类抗生素的各种培养基平板上的不同菌落生长形态,本研究共随机挑取245株抗β内酰胺类抗生素的耐药菌。它们经表型初筛和确证实验后,有76株耐药菌初步确证为产ESBLs菌株。这76株产ESBLs菌株再经PHOENIX-100系统的MIC值进行结果判定后,有56株最后确证为产ESBLs菌株。
　　 2、产ESBLs菌株的细菌鉴定:在这56株产ESBLs菌株中,肠杆科细菌有39株,其中为大肠埃希菌属(31株)、克雷伯菌属(2株)、锯齿形菌属(1株)和气单胞菌属(4株)。另外,本文还发现了苍白杆菌属(7株),Pseudochrobactrumsaccharolyticum菌属(3株)和不动杆菌属(9株)的产ESBLs菌。
　　 3、产ESBLs菌株的多重耐药情况:这些产ESBLs菌株除了对β-内酰胺类抗生素氨苄西林,哌拉西林和氨曲南以及第一、二、三、四代头孢菌素类抗生素头孢唑啉、头孢他定、头孢噻肟和头孢吡肟有较高的耐药性(耐药率都在90％以上)外,对其他类型抗生素的耐药性并不高(耐药率都低于50％),而且仍受到碳青霉烯类抗生素亚胺培南和美罗培南抑制(耐药率低于3％)。
　　 4、ESBLs基因型的检测:根据这56株产ESBLs菌株的PCR电泳和测序结果可见,blaTEM和blaCTX-M阳性菌株分别为22株和45株,而blaOXA和blaIMP阳性菌株各仅有1株,blaSHV则检测不出来。进一步,根据Blastn测序比对结果,我们获得5种blaCTX-M基因亚型,分别用A、B、C、D、E表示,其中A亚型有22株,其序列与blaCTX-M27(AB545827)有96％相似；B亚型有8株,与blaCTX-M27(AB545827)100％相似；C亚型有5株,与blaCTX-M64(AB284167)有100％相似；D亚型有6株,与blaCTX-M3(GU125712)100％相似；E亚型有4株,与blaKluY-3(AY623934)有95％相似。而22株blaTEM菌株的基因亚型均与blaTEM 139(GQ149344)100％一致。
　　 5、blaCTX-M型ESBLs基因文库:随机挑取60个阳性克隆子进行测序后,47个阳性克隆予获得正确的blaCTX-M型ESBLs基因序列,这些基因序列采用Blastn测序比对后,获得13种blaCTX-M亚型,并且形成两枝主要的blaCTX-M亚型聚类分枝。
　　 6、头孢噻肟处理的城市河流沉积物微生物群落结构及blaCTX-M多样性的研究:从聚类结果可以看出,所有样品分成两个主要的细菌群落结构聚类分枝,第一个分枝为处理前和处理后第三天的全部样品,而第二个分枝为第7天、第14天和第21天的样品。进一步,观测PCA分析结果,可以看到,实验室处理时间会导致细菌群落结构产生显著变化,而细菌群落结构变化与抗生素的有无及浓度均无显著相关性。另外,不同时间点的细菌群落多样性指标经ANOVA统计分析后显示,各样品随着实验室处理时间的延长,细菌利-类和各种类的相对数量以及细菌群落间的多样性均没有显著的差异,但细菌种类的相对均度相差显著。由此结果,本文进一步对不同时间点显示的物种均度系数进行了OneWay ANOVA分析,结果可见,7d和14d、3d和21d以及14d和21d的细菌相对均度相差显著。同时,由巢式PCR电泳结果可见,全部采样时间均有blaCTX-1检出,但blaCTX-2和blaCTX-8仪在作用前DNA(0d)检出,blaCTX-25在作用前和作用后3d检出。
　　 结论
　　 1、本文揭示了受医院废水污染的城市河流沉积物中高度多样性的ESBLs耐药机制。一方面,该沉积物中含有许多不同种属的ESBL菌,其中既有已知的肠杆菌科,也有尚未见报道的布氏菌科和Moraxellacea科的产ESBL菌；另一方面,这些ESBL菌中携带不同的耐药基因,尤其以blaCTX-M为主要耐药基因类型。blaCTX-M中既有与报道序列完全相同的已知基因,也有具有不同程度变异的潜在的新基因类型。沉积物中这些高度丰富的耐药菌种属与耐药基因,共同组成了一个多样性高度丰富的产ESBL的贮存库。本研究表明城市河流可能为产ESBL菌的社区感染提供一个重要的潜在来源。
　　 2、本文通过建立头孢噻肟的作用模型分析城市河流沉积物微生物群落结构多样性变化时,未能发现菌群在抗生素作用下发生显著变化,也未发现显著的菌群结构差异。同时,PCR结果表明耐药基因blaCTX-M随实验室处理时间的延长,多样性下降。因此,本文揭示了,对已承受排放废水污染的河流沉积物,由于其中富含大量的耐药菌群,其总体菌群结构对抗生素的作用不敏感。而且,对非原位开展的菌群结构研究,实验室处理时间是最显著的影响因素。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 城市河流沉积物产ESBLS细菌耐药表型与基因型研究

材料

实验方法

结果

讨论

第二章 头孢噻肟处理的城市河流沉积物中微生物群落结构及耐药基因blaCTX-M多样性的研究

材料

实验方法

结果

讨论

全文结论

参考文献

文献综述

参考文献

附图

中英文缩略词表

成果

致谢

统计学证明