蜕皮甾酮对兔实验性皮肤伤口的促愈合作用及其机制

摘要

1背景：
　　 伤口愈合是创伤后引起的病理过程的总称，是以组织再生为主，许多因素共同参与机体自身修复的复杂过程。正常的创面愈合过程主要包括三个阶段：炎症反应期、细胞增殖期和细胞外基质重建期。
　　 皮肤创伤常常包括表皮、真皮甚至皮肤附属器的损伤，即存在细胞功能障碍或组织缺损。其愈合过程包括伤口早期止血，创面保护，炎症控制及多种组织细胞的增生，肉芽组织的形成，创缘的爬行收缩等。而内皮细胞、上皮细胞及成纤维细胞等细胞的增殖是形成肉芽组织的关键，也是伤口愈合的关键。
　　 影响伤口愈合的因素很多，如年龄、营养状况、创面大小和一些全身性疾病等。某些因素可致伤口经久不愈，属于临床治疗上的棘手问题。慢性难愈性伤口因其伤口内坏死组织、微生物感染、机体代谢等因素导致了细胞增殖的抑制，使其停留在炎症反应期，而不进入下一个阶段细胞增殖期。虽然新技术和新手段层出不穷，但是对于慢性皮肤溃疡等难愈伤口的治疗效果却仍然欠佳。有研究指出，到2030年，全球由于慢性皮肤溃疡而需要截肢的患者将比现在增加30％以上。因此，有必要进行更深入的研究和实践，开发符合临床要求和国际标准的促愈高效药物。
　　 蜕皮甾酮(ecdysterone，EDS)在动物体内又称β-蜕皮激素。它是一种昆虫变态激素，能刺激昆虫真皮细胞分裂，产生新的表皮，导致昆虫变态，调节昆虫新陈代谢。但它在植物界的分布较动物界更为广泛，且含量较高，资源丰富。目前所应用的蜕皮激素主要由植物中提取。
　　 蜕皮甾酮在脊椎动物中也是必需的物质。研究发现，它对高等动物也表现出较强的药理活性，而且副作用小。目前所知其作用主要有：1）、促进核酸及蛋白质的合成；2）、调节糖代谢；3)、调节脂代谢；4）、调节基因表达；5）、改善免疫功能；6）、抗氧化作用；7）、促进缺血区血管的生成和侧支循环的建立；8）、促进多种细胞增殖的作用等。
　　 本课题组前期研究证明蜕皮甾酮能有效促进创伤愈合，并已制作出有明显促愈作用的蜕皮甾酮乳膏（发明专利号：200710030920.6）。本实验采用新西兰大白兔皮肤全层切除创伤模型，研究蜕皮甾酮对实验性皮肤创伤的促愈合作用及可能机制，为蜕皮甾酮乳膏在临床创伤的应用提供依据。
　　 2目的：
　　 探讨蜕皮甾酮促进皮肤创伤愈合的作用及其可能的机制，为蜕皮甾酮乳膏在临床创伤的应用提供依据。
　　 3方法：
　　 取健康新西兰大白兔40只，以戊巴比妥35mg/kg耳缘静脉注射麻醉，背部用10%硫化钠脱毛，以碘伏消毒皮肤后用外科方法剪去直径约1.8cm的圆形全层皮肤，深达肌膜，造成全皮层缺损创伤模型。每只兔子均有3个创面，标记为A、B、C，分别设为空白对照(A组，仅予一般消毒处理)、云南白药组（B组，涂抹云南白药粉，每次约0.5g）、蜕皮甾酮乳膏组（C组，涂抹2.5%蜕皮甾酮乳膏，每次涂抹量约0.5ml）。敷药后所有伤口均用凡士林油纱敷盖，再用干纱布包扎。伤口每天予盐水冲洗、碘伏消毒后各用原法处理换药。每只兔分笼饲养。
　　 随机选取10只兔子，分别于造模后4d、8d、12d观察各组创面愈合率及创面组织肉眼变化情况，并记录各创面愈合时间，进行组间比较。其余30只兔子分别于造模后4d、8d、12d处死，取组织标本，每次10只。常规HE染色、制片后，通过光镜观察组织切片病理学变化，并进行组织病理学评分来评价治疗效果。用免疫组化SP法检测各组空白切片上创缘表皮生长因子受体（epidermal growthfactor receptor, EGFR)的表达。ELISA法定量检测创面周边组织碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)含量。
　　 计量资料均以x±S表示，采用SPSS13.0统计软件分析处理数据（采用方差分析，包括One-Way ANOVA和Repeated Measures，其中两两比较用LSD或Dunnett'sT3检验）。
　　 4结果：
　　 三组皮肤创面在观察期间(0-12d)，创面随时间增加愈合率在提高，说明所造模型有一定的自然愈合能力。造模后4d，各组创面愈合率无明显差别(P＞0.05)。造模后8d及12d，C组和B组的创面愈合率无明显差别(P＞0.05)，但二者均明显高于A组(P＜0.01)。
　　 创面愈合时间统计结果显示：A组、B组和C组分别为(18.60±1.776)d，（14.80士1.229）d，（13.80士0.789）d。统计学差异显著(P＜0.01)。C组创面愈合时间最短，其次是B组，二者比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。但这两组创面愈合时间均明显少于A组(P＜0.01)，说明蜕皮甾酮乳膏与云南白药均能有效缩短创伤愈合时间。
　　 创面肉眼观察显示：造模后4d，各组创面湿润，无明显脓液形成，伤口收缩不明显。C组的创面可见少许坏死组织，其下组织略水肿；B组的创面可见含坏死组织的痂皮脱落，表皮开始向创面生长；A组的皮肤创面可见含大量炎症细胞的坏死组织，其下组织炎症细胞浸润。造模后8d，C组及B组伤口湿润、无感染，伤口表面及皮下组织收缩明显；A组仍可见渗出，个别伤口出现溃疡。造模后12d，C组及B组伤口进一步收缩，创面干燥，表面结厚痂，未愈合面积较小；A组伤口面积较造模后8d有明显收缩，创面边缘结痂，但仍有很大面积未愈合。
　　 创面组织切片光镜下观察显示：造模后4d，各组创面均以渗出和充血为主，肉芽组织增生较少，各组创面组织病理学评分无明显差别(P＞0.05)。造模后8d，C组及B组创面无充血渗出，肉芽组织形成，少许炎性细胞浸润，胶原束较多，上皮细胞少许增生；A组仍可见炎性渗出伴溃疡形成，胶原形成较少，上皮增生不明显。C组与B组创面组织病理学评分无明显差别(P＞0.05)，二者均明显高于A组(P＜0.01)。造模后12d，C组及B组创面有较多肉芽组织形成，真皮与表皮连接处少许炎性细胞浸润，大量胶原形成，上皮细胞及纤维细胞增生明显。A组胶原含量、上皮细胞及纤维细胞增生程度均低于C组和B组。C组与B组创面组织病理学评分无明显差别(P＞0.05)，二者均明显高于A组(P＜0.01)。
　　 创面组织切片免疫组化EGFR的表达情况：正常皮肤内EGFR表达为弱阳性。创伤组织EGFR的表达主要分布于创面边缘及移行区的表皮基底细胞、棘细胞、毛囊上皮、真皮成纤维细胞及血管内皮细胞、汗腺上皮的胞膜及胞浆中，坏死组织无表达。造模后4d、8d及12d，C组和B组的创面组织EGFR阳性细胞面积比均无明显差别(P＞0.05)，二者均明显高于A组(P＜0.01)。各组均为造模后8d的创面组织EGFR阳性细胞面积比最高，即在造模后8d，EGFR的表达高于造模后4d和12d(P＜0.01)。造模后12d的创面组织EGFR的表达明显高于造模后4d(P＜0.05)。
　　 创面周边组织bFGF的表达情况：造模后4d、8d及12d，C组的bFGF的表达最高，其次是B组，A组表达水平最低，各组间两两比较均有显著性差异(P＜0.01)。各组均为造模后8d的创面周边组织bFGF的表达水平高于造模后4d和12d(P＜0.01)。造模后12d的创面周边组织bFGF的表达水平低于造模后4d(P＜0.01)。
　　 5结论：
　　 蜕皮甾酮乳膏能加快兔实验性皮肤伤口的愈合过程。其机制可能是蜕皮甾酮能减轻局部炎症反应，促进肉芽组织形成，并通过上调表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子水平，促进上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞的快速增殖，使上皮爬行速度增快，新生的毛细血管增多，胶原形成明显，从而提高创面愈合速度和质量。