鸭乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株的构建及体内感染

摘要

研究背景:
　　 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染呈世界性分布,全球约20亿人曾感染过HBV,其中4亿或5％的世界人口为慢性HBV感染者,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化或原发性肝细胞癌(HCC)[1]。核苷(酸)类似物能有效抑制HBV复制,减少肝脏的炎症活动,延缓或阻止肝脏疾病的进展,减少肝癌的发生率。长期治疗导致耐药是目前核苷(酸)类似物抗HBV治疗所面临的主要难题。
　　 HBV耐药突变的产生是逆转录过程中随机发生的结果,在药物选择压力下,具有复制优势的突变株在肝脏内大量复制成为优势株。关于HBV复制周期的研究表明,共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是复制模板,可长期、稳定地存在于肝细胞核内,是慢性HBV感染无法彻底清除的根本原因。在cccDNA层面研究耐药病毒的出现、耐药毒株在肝细胞内的动态变化规律等,能更好的解释HBV耐药的临床病毒学特点,为耐药的预防和拯救治疗等提供理论基础。
　　 HBV感染具有高度种属特异性,目前缺乏有效、适宜的动物模型。与HBV同属嗜肝DNA病毒科的鸭乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B virus,DHBV),在基因序列、致病机理及感染宿主规律等方面与HBV均有相似之处。关于DHBV的研究使人们认识了嗜肝病毒的复制周期、病毒持续存在和难以彻底清除的机制。雏鸭接种DHBV感染易形成慢性感染、DHBV拉米夫定耐药模式YMDD变异与HBV类似、鸭肝体积较大可得到充裕的肝组织等,这些特点有助于我们研究拉米夫定耐药株的体内感染状态,进而探讨HBV突变株的生物学特性和耐药机理,对指导临床调整和优化抗病毒治疗方案有重要意义。
　　 研究目的:
　　 1、构建1.2倍基因组DHBV野生型及YMDD突变株的重组质粒,为建立广东樱桃谷鸭拉米夫定耐药DHBV动物模型奠定基础。
　　 2、体外转染重组质粒至鸡肝癌细胞系(LMH),研究突变株的复制活性及拉米夫定耐药性,并获得来源单一、基因序列清楚的毒种,用于体内感染。
　　 3、观察和比较DHBV野生株与拉米夫定耐药毒株接种雏鸭后形成慢性感染的特点,比较两者的体内复制活性。
　　 4、慢性DHBV感染动物应用拉米夫定抑制病毒复制,探讨半肝切除后肝细胞的快速再生能否为耐药毒株提供传播空间。
　　 研究方法:
　　 1、1.2倍鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒及其突变株的构建
　　 以广东樱桃谷鸭DHBV分离株为模板,两片段法PCR扩增DHBV质粒pcDNA3.1-DHBV2.0,获得片段NX(2232nt-3021/lnt-1229nt)和XA(1208-284lnt),分别插入pMD19-T载体,构建亚克隆:再分别经NotⅠ、XhoⅠ和XhoⅠ、ApaⅠ酶切后依次插入pBluescriptⅡ KS(+)的相应酶切位点,构建总长为3631bp片段的重组质粒PBS-DHBV1.2。利用QuikChange(R)XL Site—DirectedMutagenesis Kit对YMDD区段进行定点突变,获得突变株PBS—DHBV1.2-M512V(YVDD)。
　　 2、构建重组质粒的序列鉴定
　　 分别采用引物对DNotⅠ/DXhoⅠR、DXhoⅠF/DApaⅠ和DSF1/DSR1进行PCR扩增,初步鉴定重组质粒成功。用限制性内切酶NotⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ、ApaⅠ和XhoⅠ、ApaⅠ双酶切以及EcoRⅠ单酶切对重组质粒进行酶切鉴定。分别取三株野生株和突变株阳性克隆质粒进行插入片段DNA的序列测定,确认重组质粒的成功构建。
　　 3、瞬时转染及体外药物培养
　　 将LMH细胞接种至10cm细胞平皿(1.5×105),转染前5 h换新鲜无抗生素的Waymouth培养基。待细胞融合度80-85％时,分别将PBS-DHBV11.2或PBS-DHBV1.2-M512V质粒和报告基因pSEAP按总DNA与FuGENETM6转染试剂1:3的比例共转染LMH细胞,设未转染对照和空载体对照；转染后24小时、48小时、72小时换内含不同浓度(0ng/ml、2ng/ml、20ng/ml、40ng/ml)3TC的培养液,药物培养3天后收集LMH细胞。
　　 4、突变株重组质粒的体外复制活性与拉米夫定抗性
　　 罗氏SEAP试剂盒检测细胞上清中分泌性碱性磷酸酶(SEAP)的表达以平衡各组转染效率；抽提DHBV的复制中间体,Southern印迹杂交检测DHBVDNA复制中间体；采用KODAK Image Station2000成像系统分析Southern印迹杂交条带的灰度值,SEAP平衡转染效率后计算两种质粒的复制能力、绘制直线回归方程、求出复制抑制率为50％时的拉米夫定浓度(IC50)。同时获得细胞培养上清液,浓缩后作为体内感染实验毒种。
　　 5、DHBV野生株与拉米夫定耐药毒株慢性感染的建立
　　 5.1实验分组
　　 PCR法筛选出未感染DHBV的广东樱桃谷2日龄雏鸭17只,随机分为3组:野生株组(8只)、突变毒株组(7只)与生理盐水对照组(2只)。腹腔接种收集的细胞培养上清,连续观察70天。接种后定期经腿胫静脉采血,最后肝活检获取鸭肝组织。
　　 5.2各项指标检测
　　 提取血清DNA,采用Taqman探针荧光定量PCR法检测外周血病毒水平的动态变化；提取肝组织内DHBV复制中间体和cccDNA,行Southern印迹杂交检测；部分肝组织固定于10％甲醛溶液,常规HE染色与嗜银染色观察鸭肝脏的病理变化。
　　 5.3统计学分析
　　 所有数据采用SPSS13.0软件,连续性变量符合正态分布以均数±标准差(x±s)表示。两组整体血清病毒水平比较采用析因设计资料的方差分析(Bonferronic法);各时间点的组问病毒水平比较采用两独立样本t检验；两组DHBV慢性感染率比较采用Fisher确切概率法。所有统计采用双侧检验,P<0.05认为差异有统计学意义。
　　 6、半肝切除再生模型中DHBV突变株的动态变化
　　 6.1实验分组
　　 5只慢性DHBV感染动物其中4只(编号为V2、V3、V4、V7)持续服用拉米夫定(25mg/kg/day),每2周PCR检测血清DHBV DNA至连续两次阴性时行肝右叶半肝切除术,于肝切后48小时、72小时静脉接种突变株转染上清,并继续观察4周；未治疗鸭1只(编号为V1),仅行半肝切除与接种突变株转染上清。
　　 6.2外周血中DHBV DNA水平及克隆病毒株的检测
　　 抽提血清DNA,采用实时定量PCR检测DHBV DNA的动态变化。PCR扩增血清DHBV,产物凝胶回收后连接T载体,筛选15个阳性克隆测序。
　　 6.3肝组织PCNA表达的检测
　　 常规制备福尔马林固定的石蜡包埋组织切片,免疫组织化学染色法检测在肝脏中的表达。随机观察3个高倍视野,以肝细胞核呈界限清楚的棕色反应为阳性,使用Image-Pro-Plus-6.0图像软件分析每个视野中阳性细胞数比例。
　　 6.4单个肝细胞核的分选及核内DHBV DINA的扩增
　　 匀浆研磨10mg肝组织,匀浆液充分洗涤并滤网膜过滤。PCNA标记细胞核,流式细胞仪分选出单个肝细胞核,并获得PCNA阳性肝细胞核的百分比。分选的单个肝细胞核经蛋白酶K、EcoRI酶消化后,巢式PCR扩增DHBV的YMDD区段。
　　 6.5统计学分析
　　 数据采用SPSS13.0软件分析。配对,检验比较拉米夫定治疗动物给药前后病毒水平；文献报道拉米夫定治疗可以降低总的病毒载量,并未减少病毒感染的肝细胞数及增加肝细胞的再生。5只动物排除药物的影响,半肝切除前后PCNA的表达方差不齐,使用F检验Welch法,进一步多重比较采用Dunnett T3法；所有统计采用双侧检验,P<0.05认为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、构建重组质粒的序列鉴定
　　 构建PBS-DHBV1.2质粒的PCR扩增、酶切和核苷酸全序列测定结果均与预期相符；PBS-DHBV1.2-M512V质粒的YMDD基序氨基酸突变为YVDD。
　　 2、鸭乙型肝炎病毒YMDD突变株的表型耐药
　　 Southern印迹杂交结果显示野生株与突变株重组质粒均能在转染细胞中检出大量DHBV复制中间体,SEAP的表达平衡转染效率后,野生株的复制能力是突变株的2.7倍,拉米夫定对野生株的体外复制活性具有抑制效应,药物抑制野生株的IC50=10.90±4.80ng/ml,低于突变株的IC50=37.12±8.81ng/ml。
　　 3、DHBV野生株与拉米夫定耐药毒株慢性感染的建立
　　 3.1血清病毒水平的动态变化
　　 接种后,野生株组的病毒水平高于突变株组(7.40±2.68 vs5.82±1.10,F=29.633,P<0.01),比较各时间点两组血清病毒量(野生株组对突变株组)在10天(7.97±1.91 vs6.23±0.29,t=2.543,P=0.037)、21天(8.66±1.50 vs5.68±0.39,t=5.411,p=0.001)、28天(8.11±2.58 vs5.77±1.21,t=2.191,P=0.047)、56天(7.57±2.57 vs4.24±1.14,t=2.686,P=0.023)、70天(7.70±2.87 vs4.13±1.05,t=3.024,P=0.016)5个观测点差异均有统计学意义,即野生株组鸭外周血中病毒血症水平显著高于突变毒株组。野生株组的慢性感染率为75％高于突变毒株组43％,但因样本量较少,P=0.364两组差异无统计学意义。
　　 3.2肝内病毒复制中间体与肝组织病理学改变
　　 实验组鸭肝组织中均出现大量的DHBV DNA复制中间体,并且可以检测到DHBV cccDNA的存在,说明该时期肝内均有高水平的病毒复制。光镜下HE染色鸭肝组织显示实验组有轻微的炎症反应；嗜银染色均可见极少量汇管区芒状纤维。
　　 4、半肝切除再生模型中DHBV突变株的动态变化
　　 4.1外周血中DHBV DNA水平与克隆病毒株的检测
　　 治疗动物持续口服拉米夫定,使病毒滴度由基线的Log值7.62±2.56抑制到半肝切0天时的4.72±0.88,但因样本量较少,差异无统计学意义(t=2.439,P=0.093)。筛选血清中病毒株克隆结果显示:未治疗动物V1各时间点与治疗动物半肝切除前均为野生株；接种突变株转染上清后,V2在肝切10、17、31天时可检测到4/15(26.7％)、1/15(6.7％)、1/15(6.7％)的突变株；V3在肝切10天时突变株比例为7/15(46.7％)；V4在肝切17、31天时均为1/15(6.7％)；V7仅在肝切17天时检测到1/15(6.7％)的突变株。
　　 4.2肝组织PCNA表达的检测
　　 免疫组化检测PCNA的表达显示术前鸭肝组织中仅有极少量PCNA阳性染色肝细胞,术后PCNA肝细胞数量增多,部分细胞可见呈深棕褐色强表达。整体比较各时间点PCNA的表达指数具有显著性差异(F=169.727,P<0.001),多重比较显示半肝切10天、17天、31天时PCNA标记指数高于术前水平(0天VS10天.P=0.032,0天 VS17天.P=0.002,0天 VS31天 P<0.001)；流式标记法的检测结果与免疫组化一致,整体比较PCNA表达阳性肝细胞核比例有显著性差异(F=22.921,P=0.004),多重比较半肝切10天、17天、31天时PCNA的标记指数均高于术前(0天VS17天P=0.042,0天VS31天 P=0.029)。
　　 4.3肝细胞核内突变株比例的动态变化
　　 PCR扩增肝细胞核内DHBV结果显示:V1、V7各时间点单个肝细胞核中的DHBV均为野生株,未检测到突变株；V2在肝切10、17、31天时分别检测到4(4.4％)、3(3.3％)、2(2.2％)个突变株rtM512V,V3在肝切10天时发现90个病毒阳性肝细胞核中有5个为突变株,V4在肝切17、31天时突变株比例均为1(1.1％)。其中突变株在给药动物主要在术后10天、17天PCNA阳性细胞核内检测到。
　　 4.4半肝切除后PCNA标记阴、阳性肝细胞核的病毒阳性率
　　 流式分选出无PCNA标记、PCNA标记阳性与PCNA标记阴性的3类单个肝细胞核。巢氏PCR扩增每类30个肝细胞核内病毒,PCR产物约360bp左右。结果发现:半肝切除后,PCNA阳性肝细胞核病毒阳性率呈下降趋势,各时间点比例分别为47％±15％、52％±12％、42%±13％低于术前水平73％±19％；而PCNA阴性肝细胞核的病毒阳性率未见明显波动,且PCNA阳性肝细胞核的病毒阳性率低于PCNA阴性肝细胞核。
　　 结论:
　　 1、经体外重组,成功构建了含1.2倍DHBV全基因组片段的重组质粒及其rtM512V突变株。
　　 2、建立了DHBV野生株和rtM512V突变株克隆的DHBV复制细胞模型,并证实突变株体外复制活性减弱,对拉米夫定敏感性下降；收集含有可复制病毒颗粒的细胞上清作为接种毒种,为下一步建立标准化的体内感染模型提供基础。
　　 3、DHBV拉米夫定耐药株可形成体内慢性感染,耐药株体内复制能力低,形成慢性感染的能力较弱。
　　 4、鸭半肝切除模型可使肝细胞大量再生,突变株能感染新生肝细胞,新生肝细胞整体病毒感染率较原有细胞低,可能为游离突变株提供复制空间；耐药DHBV可以感染肝细胞并形成稳定的耐药cccDNA。