缺氧诱导因子-1a在人关节滑膜组织中表达及转染HIF-1a后滑膜细胞功能及形态研究

摘要

骨关节炎是目前骨科中年以上人群中最常见的疾病之一,约10％以上大于45岁的人群受骨关节炎影响,60岁以上人群患病率高达50％,并且患病人数随着年龄的增加逐步增多。其主要好发于负重大,活动较多的关节,以膝关节最为常见。临床上骨关节炎主要表现为关节疼痛及压痛、关节僵硬、关节肿大、骨擦音、关节无力及活动障碍等等。有研究显示超过80％以上患者都伴有不同程度的日常活动受限,致残率高达53％。其中一部分为原发性骨关节炎,另一部分为继发性骨关节炎,即因膝关节创伤、炎症、关节不稳、慢性反复的积累性损伤引起。原发性骨关节炎的病因未明,目前大量研究表明其与年龄、肥胖、遗传、免疫反应、生物力学改变、关节腔内细胞与基质代谢平衡等因素有关。近年来,随着分子生物学和分子免疫学的迅速发展,以及对细胞因子及炎症介质的深入研究,生物因素尤其是软骨及滑液代谢介质的研究越来越受到重视。关节软骨中,软骨细胞在基质的合成与分解代谢中起到重要作用,而软骨结构的稳定依赖软骨组织与蛋白多糖形成的基质的平衡。当关节微环境改变后,软骨细胞分泌基质异常,导致软骨结构破坏,在机械应力等的作用下,软骨脱落、坏死,导致软骨下骨硬化及囊性变,最终导致周围骨赘增生,关节结构破坏。
　　 众所周知,关节腔内是一个低氧环境,早期有研究表明正常人关节腔滑液中的氧含量为50-60mmHg,远远低于其他正常组织。关节软骨属于无血管组织,其中的氧浓度较滑液中更低,有研究显示表层软骨细胞周围氧浓度约为6-10％,而深层软骨细胞周围氧浓度仅为1-6％。软骨细胞主要依靠从滑液及软骨下骨中获得营养及氧分,正常软骨细胞中的ATP有75％来源于厌氧代谢,以适应关节内低氧环境。因此,关节腔内氧代谢平衡对于维持关节结构的稳定具有重要作用。大多数哺乳细胞具有氧感应系统,他们依靠上调一系列基因来维持细胞氧代谢平衡,这些因子包括红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF-A)、诱导型氮氧化物合成酶(iNOS)、葡萄糖转运酶、葡萄糖分解代谢酶、廋素等等,其中在低氧环境中起最主要调节作用的是缺氧诱导因子1(HIF-1)。
　　 缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor,HIF-1)是在研究缺氧诱导的促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)基因表达时发现的一种DNA结合蛋白。它是由HIF-1α和HIF—1β构成的异源二聚体,HIF-1α属于bHLH-PAS蛋白家族中的一员,它是HIF-1调节缺氧中特有的调控亚基。既往大量研究显示HIF—1在肿瘤发生、炎症、缺血性组织及生长板软骨发育过程中具有重要作用。目前有研究表明机体中HIF-1表达增高可以促进促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF-A)、诱导型氮氧化物合成酶(iNOS)、葡萄糖转运酶、葡萄糖分解代谢酶、度素等基因的表达,从而调节机体代谢方式。在骨关节研究中,早期发现关节软骨细胞中有HIF-1mRNA表达,随后在骨关节炎软骨中发现有HIF-1α蛋白表达的增高。然而,对其在骨关节炎发病中的具体作用仍不太明确。
　　 近年来,滑膜炎在骨关节炎的发病中的作用越来越受到重视,大量研究显示其在骨关节炎发病机制中具有重要作用。有研究表明骨关节炎中滑膜增殖与类风湿关节炎中具有相似之处,同时大量研究者从关节镜、核磁共振、彩超及分子生物学等方面研究了滑膜炎在骨关节炎发生发展过程中的作用,认为滑膜炎在骨关节炎发病过程扮演重要角色。当滑膜增殖及关节软骨退变形成后,缺氧进一步加剧,使未退变的软骨细胞更加难以抵抗恶劣的缺氧环境。但目前HIF-1α在关节滑膜病变中表达研究鲜有报道,并且对于其在细胞中抵抗缺氧的研究较少。
　　 本研究利用免疫组化技术将不同疾病及正常人膝关节滑膜组织进行染色比较,了解不同疾病HIF-1α表达差异,及其与下游蛋白表达相关关系,进一步明确其在疾病发展过程中可能的作用。提取人骨关节炎滑膜总RNA,利用基因转染技术,建立过表达HIF-1α质粒载体及将购买siRNAHIF-1α载体转染正常人滑膜细胞,研究转染HIF-1α对于缺氧培养后的细胞形态,以及在低氧条件下细胞增殖能力的影响,初步了解HIF-1α在细胞适应低氧中的功能。
　　 第一章:HIF-1α在人关节滑膜组织中表达研究
　　 目的:研究骨关节炎、慢性非特异性滑膜炎、急性创伤性滑膜炎患者及正常人膝关节滑膜组织HIF-1α、VEGF表达情况,分析相关关系,慢性非特异性患者滑膜及正常人滑膜CD34表达差异,了解HIF-1α在关节炎病变进展中的作用。
　　 方法:分别取骨关节炎滑膜组织30例；慢性非特异性滑膜炎滑膜组织45例；急性创伤性滑膜炎滑膜组织25例；正常人滑膜组织10例。制作石蜡切片,分别采用HE及免疫组化方法对所取标本分别行HIF-1α、VEGF染色,正常滑膜及慢性非特异性滑膜炎滑膜行CD34染色,了解它们在各组滑膜炎中表达情况,比较表达差异及HIF-1α与VEGF的相互关系。
　　 结果:HIF—1α及VEGF在正常人滑膜中几乎未见阳性表达,急性创伤性滑膜炎组阳性表达率分别为60％、48％,骨关节炎组阳性表达率分别为86.7％、80％,慢性非特异性滑膜炎组阳性表达率分别为68.9％、80％。HIF-1α在各滑膜炎组表达率有差异(x2=25.481,P=0.000),骨关节炎组与慢性非特异性滑膜炎组无显著差异(P=0.136),但均较急性创伤性滑膜炎组为高,差异具有显著性(P=0.000)；VEGF表达率在在各滑膜炎组表达率有差异(x2=29.333,P=0.000),骨关节炎组、慢性非特异性滑膜炎组均较急性创伤性滑膜炎组表达率高,差异具有显著性(P=0.000)。采用Sperman等级相关分析显示HIF-1α与VEGF在急性创伤性滑膜炎组、慢性非特异性滑膜炎组、骨关节炎组均成正相关,相关系数分别为0.596、0.525、0.600。MVD(CD34染色阳性)在慢性滑膜炎组表达较正常组高,且HIF-1α阳性表达患者滑膜组织中MVD较阴性者高。
　　 结论:骨关节炎患者滑膜组织中HIF-1α及 VEGF表达显著增高,它们可能在关节退变过程中具有重要作用；关节在退变、炎症、创伤时,滑膜组织均中有HIF—1α表达增高,且与VEGF有显著相关性,说明其在滑膜炎发展过程中具有促进滑膜增殖的作用；HIF-1α阳性表达滑膜的MVD较阴性高,其在促进血管增生方面具有重要作用。
　　 第二章:在人滑膜细胞(HS-4700细胞)转染HIF-1α后细胞形态及功能研究
　　 目的:通过建立过表达HIF-1α质粒载体,将过表达HIF-1α载体,HIF-1α干扰以及空载体分别转染正常人滑膜细胞,在低氧下培养转染后的滑膜细胞,了解缺氧对于转染后细胞功能及形态的影响。
　　 方法
　　 ①分别于手术时获取骨关节炎患者、急性创伤性滑膜炎患者、慢性非特异性滑膜炎及正常人滑膜组织,提取滑膜组织mRNA,利用RT-PCR检测各组滑膜组织中HIF-1α及 VEGF基因表达情况。
　　 ②根据对应的DNA模板设计原则,逆转录成cDNA片段,并插入pcDNA3.0表达载体中,构建过表达HIF-1α的HIF-1α/pcDNA3.0质粒载体,并测序验证。
　　 ③将购买的HIF-siRNA质粒载体、空载体pcDNA3.0及HIF-1α/pcDNA3.0质粒载体分别转染正常人滑膜细胞株(HS-4700),于低氧培养箱(含1％氧气、5％二氧化碳、94％氮气)中培养4小时,倒置显微镜下观察细胞形态,并利用Western Blot方法检测不同滑膜细胞中HIF-1α含量。
　　 ④将转染后的滑膜细胞置于含CoCl2的培养基中培养,细胞平板实验检测细胞增殖情况,了解HIF—1α对于细胞增殖能力的影响。
　　 结果
　　 ①RT-PCR结果显示骨关节炎滑膜组织中HIF-1α及 VEGF基因表达明显增高,急性创伤性滑膜炎及慢性非特异性滑膜炎组HIF-1α与VEGF基因表达增高,正常滑膜中未见明显表达。
　　 ②成功构建HIF-1α/pcDNA3.0质粒载体,经 DNA测序证实质粒中含有与实验设计的HIF-1α中完全一致的DNA序列。
　　 ③成功将构建的质粒载体、空载体及购买的siRNA HIF-1。转染人滑膜细胞(HS-4700),经缺氧培养后,过表达HIF-1α滑膜细胞组形态无明显改变,HIF-1α蛋白明显增多,空载体转染滑膜细胞组轻度皱缩,缺氧后HIF-1α蛋白表达增高,siRNAHIF-1α转染组明显皱缩,未检测到HIF-1α蛋白表达。
　　 ④三组细胞经低氧下平板克隆实验后,HS/HIF-1α形成多量的细胞克隆,将细胞克隆计数后经单因素方差分析,HS/HIF-1α组较HS/mock和HS/siRNA HIF-Iα增殖能力显著增高(F=195.852,P=0.000)。
　　 结论
　　 ①滑膜HIF-1α及VEGF基因表达与蛋白表达相似,在骨关节炎滑膜中表达均较高；
　　 ②HIF-1α在正常氧滑膜细胞中表达较少,但在缺氧条件下表达明显增高；
　　 ③HIF-1α基因对于滑膜细胞缺氧下增殖及形态有保护作用,可改变滑膜细胞的代谢方式,适应恶劣的低氧环境。
　　 ④HIF-1α具有促进低氧下细胞增殖的功能,可能在滑膜炎增殖阶段具有重要作用。