PDE4抑制剂咯利普兰对阿尔茨海默病的抗氧化作用

摘要

目的:建立大脑双侧海马注射Aβ25-35的阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)大鼠模型,并采用过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导氧化应激损伤的PC12细胞作为神经损伤的细胞模型,从抗氧化机制探讨咯利普兰(Rolipram,Rol)对AD大鼠的保护作用。
　　 方法:从在体和离体两方面来研究咯利普兰对AD的抗氧化作用。
　　 1.在体实验
　　 (1)AD模型的建立及分组与给药成年雄性SD大鼠大脑双侧海马注射Aβ25-35,造成AD模型后随机分为5组:假手术组(大脑双侧海马注射无菌生理盐水)、模型组(Aβ25-35组)、咯利普兰低剂量组(0.1 mg/kg)、咯利普兰中剂量组(0.5 mg/kg)、咯利普兰高剂量组(1.25 mg/kg)。动物造模24h后,假手术组和模型组给予生理盐水(10 ml/kg,ip),其余各组腹腔注射给予10％DMSO无菌生理盐水配制的药物。
　　 (2)AD大鼠学习记忆能力行为学测试AD大鼠注射Aβ25—35后,第14-15天进行避暗实验,第16-25天进行水迷宫实验。
　　 (3)AD大鼠病理组织学观察AD大鼠水迷宫实验后处死取脑,多聚甲醛溶液中避光保存做HE染色和尼氏染色的病理切片。
　　 (4)AD大鼠活性氧簇与抗氧化酶系统的测定AD大鼠水迷宫实验后处死取脑,分离海马和皮层,根据试剂盒说明书检测海马和皮层中羟自由基(·OH)、超氧阴离子(·O2-)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)水平。采用Western blot法测定海马和皮层中硫氧还蛋白(thiorcdoxin,Trx)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达水平。采用Real time-RT-PCR法测定海马和皮层中Trx和iNOS mRNA表达水平。
　　 2.离体实验:
　　 (1)H2O2诱导的细胞损伤模型的建立PC12细胞常规培养,培养液每天更换一次,2-3天传代接种。细胞加药处理前采用血清饥饿法使之同步化。加入H2O2(终浓度20～200μmol/L)分别孵育4、6、8、12、18 h,用噻唑蓝(MTT)法确立PC12细胞损伤模型。
　　 (2)咯利普兰对H2O2诱导氧化应激损伤的PC12细胞的保护作用细胞用咯利普兰和H2O2处理后,收集细胞培养液,MTT法测定细胞活力；根据乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒说明检测细胞外LDH水平,用以检测细胞膜通透性及完整性。收集细胞,用流式细胞术测定细胞周期分布。
　　 (3)咯利普兰对H2O2诱导氧化应激损伤的PC12细胞的抗氧化保护作用细胞用咯利普兰和H2O2处理后,收集细胞培养液,试剂盒测定细胞培养液中·OH、·O2-、MDA、GSH、NO和SOD水平。采用Western blot法测定细胞内Trx和iNOS蛋白表达水平。采用Real time-RT-PCR法测定细胞内Trx和iNOS mRNA表达水平。
　　 结果:从在体和离体两方面结果来研究咯利普兰对AD的影响。
　　 1.在体实验
　　 (1)咯利普兰对AD大鼠学习记忆能力的影响反复注射PDE4抑制剂咯利普兰能够显著性改善AD大鼠在被动回避实验和水迷宫的行为学。表现为在注射Aβ25-35之后第14-15天,AD大鼠在明箱停留时间较短,咯利普兰各剂量处理组大鼠则停留时间较长,对暗箱不可逃避的电刺激有较牢固的记忆。在水迷宫测试中,大鼠在水迷宫靶向获得性试验中需要更长的时间(与假手术相比)才能找到平台,而咯利普兰各剂量处理组大鼠寻找平台的时间缩短；而且,在探索性实验(移去平台)中,经咯利普兰各剂量干预的AD大鼠在目标象限(即曾经放置平台的象限)空间探索的时间延长。在可见平台测试中,各组大鼠寻找平台的时间均无显著性差异,排除了手术对动物一般活动行为的影响。
　　 (2)咯利普兰对AD大鼠病理组织学的影响HE染色:假手术组海马CA1区神经元细胞排列整齐均匀,细胞结构完整。模型组海马CA1区有结构较松散的软化灶,部分神经细胞呈缺血性形态,胞体缩小,胞核固缩,细胞数减少,胞间距离增大,神经元排列紊乱。咯利普兰各剂量组海马CA1区正常神经细胞数目较多,排列较密,胞核圆或椭圆形,核仁清晰,染色质丰富,少见固缩变性的神经细胞。
　　 尼氏染色:假手术组海马CA1区神经元排列整齐,胞体较大、细胞层次清晰,胞质内尼氏体数量多。模型组海马CA1区神经元结构模糊,数目减少,神经元排列明显疏松,皱缩成三角形或锥形,神经元胞体和树突内尼氏体溶解消失。咯利普兰各剂量组海马CA1区神经元排列整齐,神经元胞质内尼氏体较模型组增多。
　　 (3)咯利普兰对AD大鼠活性氧簇与抗氧化酶系统的影响SD大鼠注射Aβ25-35后,海马和皮层抑制·OH和·O2-活性能力显著性下降(P<0.01),与模型组相比,咯利普兰各剂量组海马和皮层抑制·OH和·O2-活性能力显著性增加(P<0.05),具有剂量依赖性趋势。
　　 SD大鼠注射Aβ25-35后,海马和皮层MDA、LDH和NO水平显著性提高(P<0.01),GSH水平和SOD活性显著性下降(P<0.01)。与模型组相比,咯利普兰各剂量组海马和皮层中MDA、LDH和NO水平显著性降低(P<0.05),GSH水平和SOD活性显著性升高(P<0.05),具有剂量依赖性趋势。
　　 Western blot结果显示,SD大鼠注射Aβ25-35后:海马Trx蛋白表达水平显著性降低,iNOS蛋白表达水平显著性升高(P<0.01),咯利普兰各剂量组均能显著性提高海马Trx蛋白表达水平,降低海马iNOS蛋白表达水平(P<0.05),具有剂量依赖性趋势,但皮层Trx和iNOS蛋白表达水平各组间均没有显著性差异。
　　 Real time-RT-PCR结果显示,SD大鼠注射Aβ25-35后:海马和皮层TrxmRNA表达水平显著性差异降低,iNOS mRNA表达水平显著性差异提高(P<0.01)。咯利普兰各剂量组均能显著性提高海马。Trx mRNA表达水平,降低海马iNOS mRNA表达水平(P<0.01),具有剂量依赖性趋势。咯利普兰0.5mg/kg和1.25mg/kg组能显著性提高皮层Trx mRNA表达水平,降低皮层iNOS mRNA表达水平(P<0.01)。
　　 2.离体实验
　　 (1)H2O2诱导的PC12细胞损伤模型倒置显微镜下观察,空白对照组细胞贴壁生长牢固,体积饱满,充分伸展,而损伤组PC12细胞体积明显缩小,突起消失,胞体变小,细胞间隙增大,细胞分布变稀疏的,出现不同程度的脱壁。损伤程度随H2O2浓度的升高加深。MTT实验结果显示,与空白对照组相比,H2O2(终浓度40μmol/L)作用16h能显著性降低细胞活力(P<0.01),且该浓度较温和,为适宜的浓度和作用时间。
　　 (2)咯利普兰对H2O2诱导氧化应激损伤的PC12细胞的保护作用MTT结果显示:与正常对照组相比,H2O2(终浓度40μmol·L-1)作用16 h能显著性降低细胞的存活率(P<0.05),细胞存活率为57.8％。不同浓度的咯利普兰预孵均能显著性降低H2O2对细胞的毒性作用(P<0.05),且具有浓度依赖性。
　　 LDH结果显示:H2O2损伤组PC12细胞,膜外LDH水平显著升高(P<0.01),咯利普兰20μmol·L-1与40μmol·L-1两浓度可显著性降低膜外LDH水平(P<0.01)。
　　 流式细胞术结果显示,H2O2刺激下,G0/G1期细胞分布百分比明显升高(P<0.01),S期细胞分布百分比明显降低(P<0.01)。咯利普兰(20和40μmol·L-1)显著减少G0/G1期细胞分布百分比(P<0.05),增加S期细胞分布百分比(P<0.01),(3)咯利普兰对H2O2诱导损伤PC12细胞抗氧化保护作用H2O2可以使细胞清除·OH和·O2-的能力明显下降(P<0.01)。咯利普兰各浓度组均可不同程度地提高细胞清除·OH和·O2-的能力(P<0.01),且具有浓度依赖性趋势。
　　 H2O2损伤后,PC12细胞培养上清液中MDA和NO水平明显升高(P<0.01),GSH含量和SOD活性明明显降低(P<0.01)。咯利普兰各浓度组均可显著性降低细胞培养上清液中MDA和NO水平(P<0.01),提高GSH含量(P<0.05),具有浓度依赖性趋势；咯利普兰40μmol·L-1组显著性提高PC12细胞培养上清液中SOD活性(P<0.01)。
　　 Western blot结果显示,H2O2使细胞内Trx蛋白水平明显降低(P<0.01),iNOS蛋白水平明显提高(P<0.01)。咯利普兰各浓度组均能明显提高Trx表达(P<0.01),具有浓度依赖性的趋势；咯利普兰40μmol·L-1组能明显降低iNOS表达(P<0.01)。
　　 Real time-RT-PCR结果显示,H2O2处理后,Trx mRNA下调(P<0.01),iNOSmRNA上调(P<0.01)。咯利普兰各浓度组均能显著性上调Trx mRNA(P<0.01),下调iNOS mRNA(P<0.05),具有浓度依赖性的趋势。
　　 结论:我们采用大脑双侧海马注射Aβ25-35造AD大鼠模型,以及采用H2O2诱导PC12细胞损伤造成神经损伤体外模型,在体与离体给予咯利普兰干预,通过生化指标及病理的指标观察咯利普兰对AD的抗氧化作用,主要结论如下:
　　 (1)咯利普兰对AD大鼠具有抗氧化保护作用,主要表现在:反复注射咯利普兰能明显改善AD大鼠的学习记忆能力；显著性改善大鼠海马CA1区的病理损伤；明显提高AD大鼠海马和皮层中抗氧化酶系统活性和硫氧还蛋白系统的调节能力,抑制氧自由基及iNOS-NO通路的激活。
　　 (2)咯利普兰能够维持受损PC12细胞膜完整性,提高细胞活力,延长细胞周期的S期及促进该期DNA合成,恢复促进细胞增殖。这种神经保护作用源于咯利普兰降低ROS含量、减少ROS的细胞毒性,进而平衡氧化系统和抗氧化系统,提高硫氧还蛋白系统的调节能力,抑制iNOS-NO通路的激活。