硫酸软骨素酶ABC对体外胶质瘢痕模型治疗作用的初步实验研究

摘要

背景：中枢神经系统(Central nervous system,CNS)是人体神经系统的最主体部分,包括脑和脊髓,其主要功能是传递、储存和加工信息,产生各种心理活动,支配与控制人的全部行为。CNS损伤后,由于病变的神经细胞不能有效地进行再生修复,而使其成为致死率、致残率高居榜首的疾病之一。因此,CNS损伤的治疗是医学界的难点,也一直是国内外研究热点。
　　 CNS损伤后,有多种抑制因素阻碍了轴突的再生,最终导致轴突再生失败或局部仅形成有限的生长。在损伤点周围形成胶质瘢痕,是CNS对损伤的一个重要的反应,并成为抑制轴突再生的一个重要抑制因素。瘢痕组织是由活化的星形胶细胞、少突胶质细胞前体细胞、激活的小胶质细胞/巨噬细胞、脑膜成纤维细胞和血管内皮细胞等组成；在胶质瘢痕中包含了多种抑制轴突再生的抑制性分子,其中最重要的一种抑制分子是硫酸软骨素蛋白多糖(Chondroitin sulphateproteoglycans,CSPGs)。有研究认为,在CNS损伤后,有多种类型的CSPG表达迅速提高,其不利于损伤的修复,导致神经轴突再生失败。还有研究表明,CSPGs发挥抑制轴突再生的结构是其氨基葡聚糖侧链,通过硫酸软骨素酶ABC(Chondroitinase ABC)消化其侧链,具有减轻抑制轴突再生的能力。在ChABC用于治疗CNS损伤的体内研究中,发现了ChABC具有使部分神经纤维再生、提高神经的塑性和促进神经恢复的作用。但是到目前为止,ChABC的去胶质瘢痕的机制还并不完全清楚,其发挥作用的最佳条件亦无统一答案。
　　 为了从去胶质瘢痕的角度促CNS损伤后的神经再生,本研究通过用不同浓度的ChABC对体外胶质瘢痕模型治疗作用的初步探讨,为后续深入研究在体CNS受损后的神经再生提供去胶质瘢痕方面的前期工作基础。
　　 第一部分、皮层星形胶质细胞、脑膜成纤维细胞的原代培养、纯化及鉴定
　　 目的:获取、传代培养及初步鉴定大鼠皮层星形胶质细胞和脑膜成纤维细胞,为下一步建立体外胶质瘢痕模型及其治疗研究奠定基础。
　　 方法:
　　 1.星形胶质细胞的原代培养、纯化、传代及成熟化培养。
　　 1.1 混合胶质细胞原代培养:取新生1～3天Wistar大鼠2只,75％酒精浸泡3～5分钟,断头处死,完整取下大脑,D-Hanks液冲洗3遍；分离大脑皮层,用显微镊仔细剥离脑膜和血管,再以D-Hanks液冲洗3遍；置青霉素小瓶中剪成≤1mm3大小的组织碎块,以0.125％胰酶5ml在室温条件下消化10～15分钟,加用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基5ml混匀终止消化;用火焰抛光的玻璃吸管轻轻吹打,直至无明显组织块；1000rpm、20℃离心5分钟,弃上清；用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬,计数活细胞,调整细胞浓度至5×105个/ml,接种至含有10％胎牛血清DMEM/F12完全培养基的75cm2培养瓶中,置37℃、5％CO2培养箱培养,3天后全量换液一次,去除死细胞碎片；每2～3天半量换液一次,促混合胶质细胞充分生长,形成细胞分层。
　　 1.2 星形胶质细胞的纯化及传代:混合胶质细胞培养至第9天全量换液,第10天用完全培养基轻轻冲洗三遍,以去除漂浮的、贴壁疏松的细胞,加10ml新鲜完全培养基,置培养箱平衡CO2气体2小时；然后取出培养瓶,旋紧瓶盖,固定在恒温摇床上37℃,250rpm,振摇15～18个小时；然后取下培养瓶,于细胞培养问内以75％酒精喷洒培养瓶表面消毒；于操作台上吸取原培养液轻轻吹打底层细胞三遍,再用新鲜培养基冲洗三遍,剩余的底层细胞主要为星形胶质细胞和极少数的少突胶质细胞；用0.25％胰酶-EDTA消化,轻轻摇动培养瓶,细胞变圆后吸管轻轻吹打下贴壁细胞,收集细胞,1000rpm离心,新鲜完全培养基重悬,按1:3的比例传代,传代后神经元受损死亡,此时细胞的主体是星形胶质细胞,还有极少数的少突胶质细胞、小胶质细胞。由于星形胶质细胞分裂相对于少突胶质细胞迅速,少突胶质细胞的比例迅速下降,此时星形胶质细胞经抗GFAP免疫荧光鉴定,纯度可达95％以上(详见结果)。
　　 1.3 星形胶质细胞的成熟化培养。体外长期培养(大于4周),大部分的细胞增殖缓慢,成为高分化成熟星形胶质细胞,用CCK8法测定1代和5代星形胶质细胞的增殖活性,进行对比。
　　 2.脑膜成纤维细胞的原代培养及传代。
　　 取新生1～3天Wistar大鼠2只,75％酒精浸泡3～5分钟,断头处死,完整取下大脑,D—Hanks液冲洗3遍；分离大脑皮层,用显微镊仔细剥离脑膜,将后者收集于青霉素小瓶中,冷D—Hanks液冲洗三遍后,用眼科剪充分剪碎,并将剪碎的脑膜组织块接种至0.01％多聚右旋赖氨酸(Poly—D-lysine hydrobromide,PDL)包被的25cm2一次性培养瓶中,加含有10％胎牛血清DMEM/F12完全培养基5ml,置37℃、5％CO2培养箱培养。每周换液3次,脑膜成纤维细胞长至融合后,按1:3传代培养,取2～5代的脑膜成纤维细胞用于实验研究。
　　 3.阳性细胞率计数方法星形胶质细胞(GFAP)和脑膜成纤维细胞(Fibronectin)进行免疫荧光染色,计算阳性细胞率。阳性细胞率计数方法:选取3个样本,每个样本随机取5个不重叠视野(200×),利用Image-Pro Plus6.0(IPP)彩色图文分析软件分别计算GFAP、Fibronectin阳性的细胞数,和总细胞数(总细胞核数),计数计算免疫荧光染色阳性率,以“均数±标准差”表示。
　　 结果：
　　 1.混合胶质细胞接种4h后,大部分细胞已经贴壁；培养4天后,细胞长至80％融合；培养至第9天,细胞分层形成,底层上形成星形胶质细胞单细胞层；中层为少突胶质细胞层；上层为小胶质细胞。纯化后的星形胶质细胞活力好,5～7天可传代。经GFAP免疫荧光鉴定,IPP图像分析检测,星形胶质细胞纯度为:95.9％±1.3％。
　　 2.脑膜组织块接种至PDL包被的25cm2细胞培养瓶后,1h内完全贴壁；1天后,组织块变得扁平,边缘圆润,并有少许脑膜成纤维细胞从组织块生长出；5天后脑膜成纤维细胞长满培养瓶。体外培养的脑膜成纤维细胞胞体较小、扁平、多呈梭形部分呈三角形和不规则形、折光性差、细胞生长快,呈火焰状生长。经抗Fibronectin免疫荧光鉴定,Image-pro plus(IPP)图像分析检测,脑膜成纤维细胞的纯度为:98.5％±0.6％。
　　 讨论及结论：本实验获得了高纯度的星形胶质细胞,经体外培养>4周后,得到了高分化星形胶质细胞；脑膜成纤维细胞体外增殖快,纯度高,活力好。可以用于后续实验。
　　 第二部分、胶质瘢痕体外模型的制作及鉴定
　　 目的:探讨体外胶质瘢痕的制作方法,为下一步的治疗研究奠定基础。
　　 方法:实验分为四个组,(1)正常星形胶质细胞对照组(A-Ctrl)；(2)星形胶质细胞机械划伤组(A-Scr):(3)星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养组(A+F)；(4)星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养结合机械划伤组(A+F-Scr)。通过对星形胶质细胞进行机械划伤和脑膜成纤维细胞两种刺激,来模拟CNS损伤后的胶质反应；并通过观察各实验组星形胶质细胞在形态学,GFAP、CSPGs蛋白表达上的变化,进而确定体外胶质瘢痕的制作方法。
　　 1.星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养:星形胶质细胞经体外培养分化成熟后,以血细胞计数板计数,调整细胞浓度为2.0×105个/ml,每孔4.0×105个星形胶质细胞,接种于PDL包被的12孔细胞培养板,置于37℃、5％CO2培养箱中培养,每周换液3次,培养5～7天,待细胞胞突连接成网络状,即取脑膜成纤维细胞用于共培养,每孔接种5.0×104个脑膜成纤维细胞,置于37℃、5％CO2培养箱中进行共培养,每周换液3次。分别于共培养1d,2d,3d并进行形态学、免疫荧光学观察,星形胶质细胞以GFAP(红色荧光)标记,脑膜成纤维细胞以Fibronectin(绿色荧光)标记。
　　 2.机械划伤:待星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养2天后,在超净工作台内,用10μL的微量移液器塑料吸嘴,在12孔板内进行“＃”字样划伤,使损伤程度和范围基本保持一致。损伤后,D-Hanks液冲洗三遍,然后加入完全培养基,置CO2孵箱继续培养。分别于损伤后0、24 h观察细胞生长情况及免疫荧光鉴定。
　　 3.结果分析
　　 对各实验组的胶质瘢痕模型标志物GFAP、CSPGs的特异性表达,进行免疫荧光染色。免疫荧光染色图片,则用IPP免疫荧光强度分析法进行评估,免疫荧光强度用平均光密度值表示,并进行各组GFAP、CSPGs免疫荧光强度的统计学分析。
　　 结果：
　　 1.星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养结果:本实验比较了正常星形胶质细胞和星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养1天、2天、3天的模型。发现脑膜成纤维细胞具有明显的促进星形胶质细胞活化和GFAP的表达作用。A-Ctrol组,星形胶质细胞分化成熟、胞突丰富,免疫荧光显示:GFAP主要表达在核周围的细胞骨架上；A+F组共培养1天后,星形胶质细胞增长的胞突向脑膜成纤维细胞生长,并将其包围,且与脑膜成纤维细胞接触的胞突,GFAP染色荧光更明亮；共培养2天后,脑膜成纤维细胞周围形成星形胶质细胞活化点,GFAP染色呈强阳性；共培养3天后,活化点更明显,大量的星形胶质细胞聚集到脑膜细胞周围,伸长的胞突长入脑膜成纤维细胞集落区,与脑膜成纤维细胞紧密地长在一起,形成瘢痕样结构,GFAP染色呈强阳性。
　　 2.机械划伤后,A-Scr组、A+F-Scr组星形胶质细胞胞突迅速向划痕中央生长,4小时即可观察到胞突生长；24小时后划痕两侧的星形胶质细胞胞突有少部分接触,且在划痕中央可以见到迁移的星形胶质细胞；免疫荧光染色显示:划痕两侧星形胶质细胞的胞突粗大、GFAP表达增强,在A+F-Scr组划痕处的星形胶质细胞GFAP表达亦强于远离划痕处的星形胶质细胞。
　　 3.胶质瘢痕模型鉴定结果:
　　 A-Ctrl组:GFAP荧光染色均匀但较弱,平均光密度值为0.1746±0.0039；CSPGs荧光微弱,平均光密度值为0.0075±0.0007。
　　 A—Scr组:划痕边缘星形胶质细胞GFAP荧光明显增强,平均光密度值为0.2554±0.0061；CSPGs主要表达于划痕边缘,荧光也较对照组增强,平均光密度值为0.0111±0.0007；
　　 A+F组:GFAP的荧光强度和A-Scr组相似,但分布较均匀,在与脑膜成纤维细胞交界处,GFAP荧光更强,平均光密度值为0.4645±0.0049;CSPGs的荧光强度也明显较正常星形胶质组和正常星形胶质细胞划伤组的强,主要分布于星形胶质细胞胞体上,胞核未见荧光染色,平均光密度值为0.0398±0.0008。
　　 A+F-Scr组:具有A-Scr组和A+F组共有的特征,其GFAP平均光密度值为0.5042±4:0.0051,CSPGs平均光密度值为0.0410±0.0006。
　　 统计分析显示各胶质瘢痕模型组间GFAP的荧光强度差异有统计学意义(F=15020.345,P<0.05):CSPGs的荧光强度差异有统计学意义(F=9878.761,P<0.05)。
　　 讨论及结论:机械划痕及脑膜成纤维细胞这两种刺激因素均对星形胶质细胞起有激活作用,其中以脑膜成纤维细胞对星形胶质细胞的刺激作用更强；星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养结合机械划伤,是制作体外胶质瘢痕模型的有效方法。
　　 第三部分、ChABC去胶质瘢痕体外实验的初步研究
　　 目的:研究不同浓度的ChABC对体外胶质瘢痕模型的治疗作用,初步探索去胶质瘢痕的有效方法和条件。
　　 方法:将实验分为四组:胶质瘢痕模型未治疗组(untreated control group)、1μU/mlChABC治疗组、2.5μU/mlChABC治疗组、5μU/mlChABC治疗组。采用星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养结合机械划伤方法制成体外胶质瘢痕模型,并对胶质瘢痕模型进行编号,将不同浓度的ChABC依分组条件加入到对应的胶质瘢痕模型中；作用24小时后,利用免疫荧光技术观察三种不同浓度的ChABC对体外胶质瘢痕模型中的GFAP和CSPGs蛋白表达的影响。值得一提的是,由于新近有观点认为ChABC能专一地降解CSPGs的侧链,使其丧失抑制神经轴突再生的特性；小鼠抗CSPG抗体(Sigma,克隆区CS-56)能够识别完整的CSPGs,而经ChABC降解后的CSPGs,则无法由CS-56识别,因而可以将CSPGs用于观察ChABC对体外胶质瘢痕模型的治疗效果。有关实验数据处理,对每个蛋白(包括GFAP和CSPGs)、每个分组选择三个孔,每个孔随机拍摄5张图片,利用Image-Pro Plus6.0彩色图文分析软件,测量图像的免疫荧光强度。免疫荧光强度用平均光密度值表示,平均光密度值=IODsum/Area。用SPSS13.0软件进行统计学分析,计量资料用“均数±标准差((X)±SD)”表示,比较采用t检验或One-way ANOVA方差分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:胶质瘢痕模型经不同浓度的ChABC处理后,GFAP免疫荧光无明显变化,荧光明亮；CSPGs免疫荧光经由低到高浓度ChABC治疗后,荧光强度逐渐减弱,1μ/mlChABC治疗组荧光稍减弱,2.5μU/mlChABC治疗组荧光显著减弱,5μU/mlChABC治疗组几乎见不到荧光。各组的GFAP、CSPGs免疫荧光强度用平均光密度值表示如下:(1)胶质瘢痕模型未治疗组:GFAP平均光密度值为0.5061±0.0086；CSPGs平均光密度值为0.0416±0.0031。(2)1μU/mlChABC治疗组:GFAP平均光密度值为0.5101±0.0071；CSPGs平均光密度值为0.0350±0.0022。(3)2.5μU/mlChABC治疗组:GFAP平均光密度值为0.5082±0.0097；CSPGs平均光密度值为0.0095±0.0018。(4)5μU/mlChABC治疗组:GFAP平均光密度值为0.5039±0.0087；CSPGs平均光密度值为0.0003±00003。
　　 各组间GFAP荧光强度未见显著变化,差异无统计学意义(F=1.463,P>0.05)；CSPGs的荧光强度随ChABC治疗浓度的增大,逐渐减弱,差异具有统计学意义(F=1334.634,P<0.05)；各治疗组间相比,以5μU/mlChABC治疗组的治疗效果更好。
　　 讨论及结论:ChABC对体外胶质瘢痕模型具有较好的治疗作用。本实验条件下以5μU/mlChABC治疗组的治疗效果更好。