重组人促红细胞生成素对创伤性脑损伤后炎症反应和神经细胞凋亡的干预作用

摘要

研究背景:创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury TBI)是儿童和青壮年死亡和致残的重要因为,给社会和家庭带来严重的医疗和经济负担。流行病学调查资料显示,当今我国颅脑外伤的发生率己超过100/10万人口,尽管近十年来,颅脑外伤的基础和临床研究取得了很大的进步,新的理论不断产生和发展,但是目前仍然没有明显有效的治疗措施能减少死亡和致残率。TBI后的病理生理过程至今仍然不清楚。创伤性颅脑损伤是由直接的头颅撞击或者加速性、减速性损伤引起的。这些损伤因素将导致脑组织受压、脑皮层挫裂伤、水肿、出血和缺血。在细胞水平上,原发性损伤将触发一系列病理级联过程,包括激活炎症反应、产生氧自由基、释放兴奋毒性神经递质、激活细胞内各种酶。这些可导致细胞结构的破坏和激活细胞凋亡途径。此外这些继发或者延迟的细胞损伤将可能持续至伤后1年以上。TBI后继发性脑损伤的潜在分子机制迫切需要深入系统的研究,尤其是需要开发新的神经保护药物来减轻TBI后的继发性脑损伤。
　　 研究显示炎症反应在创伤性脑损伤(TBI)后的继发性脑损害中具有重要的地位,而NF-κB作为核转录因子,已被证明在TBI后的炎症反应的调控中处于中心地位,介导着下游炎症因子、趋化因子、急性期蛋白、细胞凋亡/抗凋亡基因的激活转录。TBI后各种炎症因子比如炎症细胞激活,聚集、白介素-1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、细胞间粘附分子(ICAM-1)等明显升高且呈持续表达,与之相伴的会出现脑组织水肿,血脑屏障破坏、神经细胞凋亡增加。研究已显示TBI后抑制NF-κB的激活水平,能明显降低各种炎症因子水平,减轻脑组织的炎症反应。因此,针对颅脑损伤后的炎症反应进行干预,将可能减轻TBI后的继发性脑损伤,提高TBI患者的临床预后。
　　 促红细胞生成素(EPO)是一个由165个氨基酸组成的,分子量为30.4 kDa的氨基酸糖蛋白激素。属于Ⅰ型细胞因子超家族的成员之一。EPO由胎儿肝脏生成,出生后短时间内转至由肾脏产生。最初认为EPO只作用于红系前体细胞。但是,研究显示EPO是一个多效因子,具有非造血功能。近年来EPO作为一种多效的中枢神经系统保护因子得到了广泛的研究。发现其对神经系统的发生、维持、保护、修复都有作用。目前研究主要集中于补充外源性EPO后对神经细胞凋亡、神经细胞分化、认知功能等的影响。在TBI中,研究显示EPO具有抗凋亡、减轻脑水肿、促进神经细胞再生、减少兴奋性氨基酸毒性以及抗氧化等作用。但是对TBI后给与外源性EPO对NF-κB及其下游促炎症因子的影响以及NF-κB在EPO的抗神经细胞凋亡的作用如何研究较少。所以,通过研究EPO对TBI后继发性脑损伤中NF-κB DNA结合活性及下游炎症反应的影响,可进一步明确EPO的脑保护机制。
　　 目的:通过研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)对大鼠创伤性脑损伤后皮层核因子κB(NF-κB)DAN结合活性、下游炎症因子TNF-α、IL-6、创伤灶周边脑组织水含量、神经细胞凋亡影响,进一步阐明rhEPO在TBI后的神经保护作用机制,为rhEPO的进一步临床使用提供理论依据,并未开发TBI后治疗药物提供新的思路。
　　 方法:将54只Wistar大鼠随机等分成三组:对照组(Control组,n=18)、脑外伤组(TBI组,n=18)、脑外伤后+EPO组(TBI+rhEPO组,n=18)。外伤组大鼠行右侧顶骨钻孔术,应用改进的Feeney’s自由落体模型装置制作大鼠脑外伤模型,对照组大鼠仅行右侧顶骨开窗,不做头颅打击。TBI+ThEPO组伤后立即给与腹腔注射rhEP05000IU/kg(用0.9％生理盐水4ml/kg稀释),每24小时1次,直到各组处死前。TBI组和对照组伤后则立即给予同等溶积0.9％生理盐水(4ml/kg)腹腔注射。伤后3天处死动物。各组随机取6只大鼠切取损伤灶周围5mm的脑组织保存于-80℃,用于NF-κB结合活性、炎症因子水平的检测。6只大鼠行伤侧脑组织含水量检测,6只行皮层神经细胞凋亡检测。
　　 1.凝胶电泳迁移率实验(EMSA)法检测NF-κB结合活性参照试剂盒内说明书进行操作:取1.75 pmoL/μl未标记的双链NF-κB寡核苷酸探针(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG-3’)和T4多核苷酸激酶,用[γ-32P]ATP进行标记,总反应体积为10μl(其中核蛋白60μg,[γ-32P]ATP标记的NF-κB探针1μl,缓冲液2μl,余为自由水),混匀后4℃放置20min,上样于聚丙烯酰胺凝胶样品孔中,恒压150 V电泳2小时。电泳结束后轻轻揭下凝胶,放人暗盒中-80℃曝光、显影,采用Image J图像分析软件测量显色阳性区的平均灰度值。
　　 2.双夹心酶联免疫吸附实验检测挫伤脑组织IL-6、TNF-α浓度采用大鼠ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6浓度,严格按照说明书进行上样、洗板、孵育、显色等操作。终止反应5分钟内,采用酶标仪(美国BID-RADmodel680)测量标本OD450值,根据标准品绘制标准曲线,计算各孔蛋白浓度,蛋白浓度以ng/g表示。
　　 3.干湿比重法测定伤侧脑组织含水量根据公式:(湿重-干重)/湿重×100％计算脑组织含水量百分比。
　　 4.TUNEL检测伤侧皮层周围神经细胞凋亡应用原位细胞凋亡(TUNEL)法检测大鼠伤侧皮层周围神经细胞凋亡情况,按试剂盒说明书操作,在显微镜下凋亡细胞核呈棕黄色至深褐色,对损伤灶周围脑皮层中10个相邻的10×40倍视野内总神经细胞数TUNEL阳性神经细胞数进行计数,以平均每100个神经细胞中的TUNEL阳性细胞数作为凋亡指数。
　　 统计学分析:所有数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析。定量资料结果以均数±标准差((x)±S)表示。多组之间比较采用单因素方差分析,组间多重比较根据组间方差齐同性检验,分别选取不同的方法,按0.05的检验水准,若方差齐,采用LSD检验,若方差不齐用Tamhane's T2检验。以P≤0.05认为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.大体观察和与实验结果:试验中所有54只Wistar雄性大鼠体重变化无显著差异。颅骨钻孔术和外伤模型制作过程中,操作步骤一致。所有实验动物均存活。
　　 2.脑组织NF-κB的变化:TBI后挫伤灶周围脑组织中NF-κB DNA结合活性于伤后第3天较对照组显著升高(P<0.01)。给与EPO腹腔注射后,TBI+EPO组中NF-κB DNA结合活性较TBI组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 3.脑组织TNF-α和IL-6的变化:TNF-α和IL-6在TBI后第3天达明显升高,分别达(2.189±0.359)ng/g、(0.821±0.06)ng/g,两者差异有显著统计学意义(P<0.01)。给与rhEPO治疗后,伤后第3天时两者明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　 4.伤侧脑组织水含量的变化:TBI后第3天时,伤侧脑水肿较对照组显著升高,分别为(77.435±0.556)％和(79.342±0.724)％,差异有显著统计学意义(P<0.01)。给与EPO治疗后,TBI+rhEPO组伤侧脑水肿较TBI组明显降低,为(78.148±0.362)％,差异有显著统计学意义(P<0.01)。
　　 5.损伤灶周围神经细胞凋亡的变化:对照组TUNEL阳性细胞不明显,TBI后第3天,创伤灶周围可见大量棕黄色至深褐色TUNEL阳性细胞,与对照组相比差异有显著性统计学意义(P<0.01)；给与rhEPO治疗后,TBI+rhEPO组皮层中TUNEL阳性细胞明显减少,与TBI组相比差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 结论:免疫炎症反应在创伤性颅脑损伤后继发性脑损伤中具有重要作用。NF-κB处于炎症反应的核心部位。重组人促红细胞生成素在创伤性脑损伤后能够明显抑制脑组织中NF-κB DNA结合活性,降低下游炎症因子水平、减少神经细胞凋亡、减轻脑水肿,发挥显著的脑保护效应,这可能是rhEPO作为多效性的神经保护因子的机制之一。rhEPO能明显降低创伤侧脑组织中NF-κB DNA结合活性的同时脑水肿程度、神经细胞凋亡都明显减轻。我们推测rhEPO通过降低NF-κB DNA结合活性,导致下游炎症因子水平的降低,对脑组织具有保护作用。同时,NF-κB的不同二聚体形式在创伤性脑损伤后的皮层神经元的凋亡中可能存在不同的作用。rhEPO可能通过促进神经元中起神经保护作用的含c-Rel亚基的二聚体表达,抑制小胶质细胞和星型胶质细胞中促炎二聚体(P50/P65)表达而产生神经保护作用。