南方汉族终末期肾功能衰竭患者HLA基因及单倍型多态性分析

摘要

终末期肾功能衰竭(End-stage renal disease,ESRD)是指各种原因造成的慢性进行性肾实质损害,致使肾脏明显萎缩,不能维持其基本功能,临床出现以代谢产物潴留,水、电解质、酸碱平衡失调,全身各系统受累为主要表现的临床综合征,也称为尿毒症。各种肾脏疾病持续进展,最后均可导致终末期肾功能衰竭。据有关发达国家统计,慢性肾衰的发病率与患病率均有上升趋势。美国慢性肾衰患者的总数已达1363万,其患病率为9.9％o,我国报道终末期肾功能衰竭患者患病率也高达0.1‰。众所周知,慢性肾衰是一种严重危害人民健康和生命的常见病,而且治疗费用昂贵,对家庭和社会都造成了沉重的经济负担。但其发病机制尚未清楚,除外目前解释CRF的肾小球高灌注、高压力、高滤过,肾小球囊内高压,肾小管高代谢及肾脏代偿性肥大等理论；肾小球和肾间质的变化,肾小球、肾小管间质细胞及肾脏浸润细胞产生的大量免疫炎性细胞因子,也参与了肾功能恶化的过程。
　　 人类白细胞抗原系统是人类主要组织相容性复合体(Major histocompatibitilycomplex,MHC),是编码HLA的基因群,是人类基因组计划完成并公布的人体最复杂的免疫复合体。HLA分成三类基因区,Ⅰ类基因包括经典的A、B、C位点,非典型区E、F、G位点等,在免疫系统中起识别自我和非我的功能,因此在免疫系统抵抗病毒和肿瘤中起重要作用；Ⅱ类基因包括经典区DP、DQ、DR.位点,非典型区DN、DM、DO位点等,其编码的产物主要与抗原的处理、加工和提呈有关；Ⅲ类基因包括包括C2、Bf、C4A、C4B等补体成分编码基因和MIC、LTA、TNF、LTB、HSP70等,其中后者的表达产物与炎症反应有关。在1958年经Dausset发现,HLA便成为医学界最活跃的研究领域之一,最终导致了一门新兴的边缘学科-免疫遗传学的迅速发展。随着研究的逐步深入,HLA在人体生理、病理机制中的重大作用越来越多地被证明,发现它不仅在移植排斥、免疫应答的遗传控制和调节、免疫细胞的相互识别和限制等方面有重要的意义,而且在与疾病的相关性方面有着极其重要的临床价值。
　　 肾脏病多数是免疫介导的炎症反应所致,在其发展过程中有很多免疫炎性因子的参与,如NK细胞,B细胞,T细胞,血小板,粒细胞等,这些免疫活性细胞需要HLA作为免疫反应的配体与其细胞膜上的受体结合才能发挥免疫炎性反应。而且有学者对肾衰患者进行肾活检发现肾小球系膜区有HLA-Ⅲ类基因编码的产物补体C4的沉积,这些均说明HLA在肾脏病的发生、发展过程中起着重要作用。所以通过研究等候肾移植的终末期肾功能衰竭患者HLA分型资料与健康人群的比较,寻找与ESRD存在易感的HLA基因及单倍型是非常有必要,而且具有实际临床意义。近年来国外一些移植中心对HLA在导致各类肾脏疾病最终进展为终末期肾功能衰竭进程中所起的免疫遗传作用做了较多研究,并提出可能的易感基因和保护基因。Rogus JJ等通过家系研究提出1型糖尿病肾病患者并发终末期肾衰,易感基因在其发病中起重要作用,并提出易感基因可能位于人六号染色体短臂HLA区域。KARAHAN GE等报道土耳其587例不同原发病最终并发终末期肾衰竭患者高表达HLA-B58,DR3,并认为易感基因的确定可能对延缓肾脏疾病患者向ESRD进展和预防移植后原发病再发有重要意义。
　　 国内尚无大样本资料研究HLA与ESRD的相关性。本课题以等候肾移植的终末期肾功能衰竭患者、正常健康人群为研究对象,采用序列特异性引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction sequence specific primer,PCR-SSP)技术检测终末期肾功能衰竭患者HLA-A,B,DRB1基因分型及单倍型多态性,与健康人群进行比较,探讨HLA在因各类肾脏病导致患者最终并发终末期肾功能衰竭进程中的免疫遗传易感性。
　　 第一章终末期肾功能衰竭患者HLA基因多态性分析
　　 目的:通过对等候肾脏移植的患者进行HLA-A,B,DRB1基因表达的研究,与健康对照组相比较,以探讨在因肾脏疾病导致患者最终并发终末期肾功能衰竭(End-stage renal disease,ESRD)进程中的HLA免疫遗传易感性及其相对风险作用。
　　 方法:对3911例终末期肾功能衰竭患者(病例组)和4707例无血缘关系随机健康献血者(对照组)采用PCR-SSP方法检测两组HLA-A,B,DRB1三个座位的基因分型。应用SPSS13.0统计分析软件分析数据,HLA基因表现型频率(phenotype frequencies,PF)=观察到的HLA基因阳性个数(n)/被研究人数,基因频率(gene frequencies,GF)应用公式GF=1-(1-PF)1/2计算。两组基因表现型频率、基因型频率的比较采用四格表x2检验。两组比较的OR值通过Woolf公式计算。对P值计算其校正Pc值(以P值乘以所检测的某一位点的抗原数即Pc值表示)。由于我们比较的抗原数较多,容易造成统计学上的Ⅰ类误差,即有可能完全由于机会而表现出HLA基因与ESRD有统计学意义的关联,故需校正P值,即P值乘以被比较的抗原数,有时校正后仍会出现Ⅰ类误差,给合相关文献,我们将Pc值设定为<1×10-5具有统计学差异,所有统计计算均由SPSS13.0完成。
　　 结果:1、ESRD患者组检出HLA-A位点基因19个,对照组检出17个。ESRD患者组比对照组多检出的基因为A*25和A*80。在ESRD患者组中HLA表型频率显著降低的是HLA—A*30(Pc<0.00001),未发现频率显著升高的基因。
　　 2、ESRD患者组检出HLA-B位点基因41个,对照组检出38个,仅在ESRD患者组中检出的基因为HLA-B*28、B*42、B*72、B*78和B*73,仅在对照组中检出的基因为HLA-B*47和B*64。在ESRD患者组中表型频率显著升高的基因为HLA-B*75(Pc<0.00001,OR=1.479,95％CI=1.315-1.664),未发现频率显著降低的基因。
　　 3、ESRD患者检出HLA-DRB1位点基因14个,对照组检出13个。ESRD患者组比对照组多检出的基因为HLA-DR*18。在ESRD患者组表型频率显著升高的基因为HLA-DR*04(Pc<0.00001,OR=1.294,95％CI=1.172-1.428)、HLA-DR*17(Pc<0.00001,OR=2.639,95％CI=2.240-3.110),显著降低的基因为HLA-DR*08(Pc<0.00001,OR=0.697,95％CI=0.615-0.791)。
　　 结论：1.HLA在不同地区,不同种族表现出与ESRD相关联的易感基因和保护基因不同。
　　 2.HLA-A*30虽然在病例组和对照组表型频率比较中具有统计学差异,但其在两组中的频率均较低,结合临床,认为其不与ESRD存在关联。
　　 3.HLA-B*75、DR*04和DR*17可能对我国南方汉族肾脏疾病患者最终并发ESRD具有独立易感关联,而表达HLA-DR8的肾脏病患者将可能延缓发生ESRD。
　　 4.我国南方汉族肾脏病患者可能并发ESRD的易感基因和保护基因的发现对于本地区等候肾脏移植患者选择合适供体,提高移植后患者生存时间和远期移植效果具有临床指导意义。
　　 第二章HLA易感基因相应单倍型与ESRD易感关联分析
　　 目的：通过多中心大样本等待肾移植受者的HLA分型资料与健康人群对照分析,发现HLA-B*75,DR*04,DR*17是终末期肾功能衰竭(End-stage renaldisease)的易感基因,在此基础上分析与其相关单倍型在病例组和对照组的分布,探讨与终末期肾功能衰竭存在易感关联的HLA单倍型。
　　 方法：应用人口遗传学软件Arlequin统计分析ESRD患者组和对照组HLA两位点单倍型频率,通过卡方检验筛选病例组具有统计学差异的单倍型,计算其优势比(odds ratio,OR)。对P值计算其校正Pc值(以P值乘以HLA每两位点所检出的单倍型数即Pc值表示)。
　　 结果：1.ESRD患者组表达HLA易感基因B*75-A位点单倍型11条,对照组患者组表达HLA易感基因B*75-A位点单倍型7条。仅在ESRD患者组中表达的单倍型为A*33-B*75,A*66-B*75,A*03-B*75,A*29-B*75,A*34-B*75,A*68-B*75(频率分别为0.268％,0.051％,0.049％,0.046％,0.037％,0.022％)。仅在对照组表达的单倍型为A*30-B*75,A*25-B*75(频率分别为0.057％,0.040％)。两组对比,单倍型频率未发现有显著差异。
　　 2、ESRD患者组表达HLA易感基因DR*04-B位点单倍型27条,仅在ESRD患者组中表达的单倍型为B*44-DR*04,B*37-DR*04,B*57-DR*04,B*81-DR*04,B*28-DR*04(频率为0.166％,0.111％,0.061％,0.051％,0.013％)。对照组表达HLA易感基因DR*04-B位点单倍型25条,仅在对照组表达的单倍型为B*63-DR*04,B*49-DR*04,B*42-DR*04(频率均为0.040％)。两组对比,ESRD患者组中单倍型频率显著升高(Pc<0.05)的是B*13-DR*04(1.149％vs0.043％),B*46-DR*04(1.952％ vs0.758％),B*58-DR*04(0.957％vs0.138％),B*75-DR*04(1.354％vs0.450％)。
　　 3、ESRD患者组表达HLA易感基因DR*17-B位点单倍型31条。对照组表达HLA易感基因DR*17-B位点单倍型16条。ESRD患者组比对照组多表达的单倍型为B*13-DR*17,B*62-DR*17,B*39-DR*17,B*61-DR*17,B*48-DR*17,B*56-DR*17,B*07-DR*17,B*45-DR*17,B*76-DR*17,B*18-DR*17,B*77-DR*17,B*72-DR*17,B*78-DR*17,B*63-DR*17,B*42-DR*17。两组对比,在ESRD患者组中未发现频率显著升高的单倍型。
　　 结论：
　　 1.HLA在不同地区,不同种族表现出与ESRD相关联的易感单倍型和保护单倍型不同。
　　 2.单倍型B*13-DR*04,B*46-DR*04,B*58-DR*04,B*75-DR*04在ESRD患者组中频率均显著增高,但其中单倍型B*75-DR*04(Pc<0.05,OR=3.101,95％CI=1.664-5.779)是由独立易感基因B*75,DR*04组成,具有集合易感意义,推测为与终末期肾功能衰竭相关的易感单倍型。