n-3多不饱和脂肪酸通过AA代谢通路促进骨折愈合

摘要

一、研究背景:
　　 骨折愈合是一个复杂的生物学过程，其关键在于炎症反应、软骨形成、软骨内骨化、膜内骨化和骨痂塑形等重要细胞过程。骨折愈合中软骨内骨化始于骨髓基质干细胞聚集并初期分化为软骨细胞，随后位于中央的软骨细胞经增殖、成熟、肥大，随后经过终末期分化、基质钙化而软骨内骨化。骨折愈合中骨痂软骨细胞，与骨骼骨发育过程中骺生长板软骨细胞相似，可分为初期分化、增殖期、成熟期和肥大期，经终末期分化、基质钙化而软骨内骨化，但骨痂中软骨细胞排列较紊乱，不如骨骺生长板中软骨细胞柱规则。
　　 动物模型常用于研究骨折愈合，与大动物相比小鼠骨折模型有许多优点，最为重要的是，小鼠有广泛的抗体谱和基因靶目标可用，可进行骨折愈合和再生的分子机制研究。随着小鼠基因图谱的绘制，近年来转基因小鼠和基因敲除小鼠的出现，能够有机会观察单个基因在骨折愈合中的作用，小鼠成为很好的实验动物，因此，小鼠骨折模型被认为是理想的骨折模型。与小鼠胫骨相比，股骨是形态较直的长管状骨，内外径相对一致，建立标准的骨折模型较易，且骨折愈合后可进行扭转力学、三点应力、四点应力等生物力学特性检测，所以骨折模型多选用股骨骨折模型。为进行骨折愈合过程中软骨内骨化的研究，我们采用髓内针固定建立小鼠闭合性股骨骨折模型。
　　 多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，PUFAs)是具有3个以上双键的18-24碳脂肪酸，是细胞膜磷脂的主要成分，依据第一双键的位置不同可分为n-3PUFAs和n-6PUFAs。n-6PUFAs主要包括亚油酸(linoleicacid,LA)和花生四烯酸(二十碳四烯酸，arachidonicacid,AA)。n-3PUFAs主要包括亚麻酸(alpha-linolenicacid，ALA)、二十碳五烯酸EPA(eicosapentaenoicacid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)。
　　 n-3PUFAs在许多疾病中起有益作用。n-3PUFAs对于正常生长发育是至关重要的，对于预防和治疗许多临床疾病是重要的。n-3PUFAs能改善高脂血症，对心血管疾病、2型糖尿病起防治作用。n-3PUFAs具有抗肿瘤作用。n-3PUFAs还具有炎性保护作用，对类风湿性关节炎及自身免疫性疾病具有治疗效果，对结肠炎具有保护作用。
　　 就骨健康而言，n-6PUFAs(AA)和n-3PUFAs(EPA、DHA)是最重要的脂肪酸。AA的代谢产物类前列腺素(prostanoids，PGs)和白三烯(leukotrienes，LTs)，作为炎性介质促进或抑制骨与软骨代谢。近年来，n-3PUFAs对小鼠、大鼠及人类骨代谢起有益作用逐渐被报道。n-3PUFAs对骨钙平衡是有益的，可促进和维持骨密度，能改善骨微结构和生物力学强度，对健康、衰老、雌激素缺乏及炎性状态下的骨健康起保护作用。n-3PUFAs对骨代谢是有益，但目前国内外尚缺乏n-3PUFAs对骨折愈合影响的研究，而此类研究对临床具有重要意义。
　　 二、研究目的:
　　 1.研究n-3多不饱和脂肪酸对骨折愈合的影响
　　 2.研究n-3多不饱和脂肪酸对骨折愈合的作用机制
　　 三、研究方法:
　　 1.建立小鼠闭合性股骨骨折模型
　　 本研究中，根据三点折弯应力原理，改良设计制作用于制造小鼠股骨骨折的骨折模型架，设立了理想的打击重量、打击速度、打击深度等参数，造成稳定一致的股骨横形骨折。小鼠的骨骼细小，且周围软组织丰厚，建立标准闭合性骨折模型时，需要有丰富的解剖基础和外科手术技术。通过大体解剖和影像学观察，了解小鼠股骨形态结构特点。采用股骨逆行髓内针手术技术，通过骨折造模架，造成闭合性股骨中段骨折，在股骨髁间切迹向髓腔内插入钢针固定。术后影像学和组织学观察，证实本研究采用髓内钉手术技术建立小鼠闭合性股骨骨折模型，其骨折愈合为典型的软骨内骨化。
　　 2.观察方法
　　 组织学观察:脱钙小鼠股骨骨折标本采用番红O-固绿染色进行组织学观察。X线观察:术后不同时间点，采用KodakDirectviewDR3500拍摄X线片，确定骨折类型，观察骨折愈合过程影像学变化情况。softX-ray观察:采用GESenographe2000D拍摄股骨骨折标本的正位和侧位片，获得高分辨率影像，分析骨折愈合过程中骨痂大小变化情况，进一步观察骨折愈合情况。micro-CT观察:采用广州中科恺盛医疗技术有限公司的ZKKS-MCT-Ⅲmicro-CT进行扫描及数据处理，观察骨折塑型情况。
　　 3.fat-1转基因小鼠作为研究n-3PUFAs对骨折愈合影响的良好工具
　　 来源于小秀丽线虫(C.elegans)fat-1基因编码n-3脂肪酸去饱和酶，可将不同的n-6脂肪酸转化为相应的n-3脂肪酸。哺乳动物缺乏fat-1基因，正常情况下不能合成n-3PUFAs，必需依靠饮食补充。同时，n-3PUFAs的来源是有限的。fat-1转基因小鼠内源性产生n-3PUFAs，各组织中相应的n-3PUFAs含量增加，相应地n-6PUFAs含量明显减少，细胞膜n-6/n-3PUFAs比率降低，是研究n-3PUFAs起有益作用的良好工具。因此，我们利用at-1转基因小鼠与野生型C57BL/6J小鼠对比，研究n-3PUFAs对骨折愈合的影响。实验小鼠分为2组，Fat-1:fat-1基因阳性的小鼠;WT:fat-1基因阴性的小鼠或C57BL/6J小鼠，通过建立小鼠股骨骨折模型来研究内源性n-3PUFAs对骨折愈合的影响。
　　 4.外源性AA改变n-6/n-3PUFAs比率
　　 通过喂饲AA油剂，增加n-6/n-3PUFAs比率，或fat-1转基因小鼠内源性降低n-6/n-3PUFAs比率，调节AA代谢通路中的底物AA。实验小鼠分为4组，即C组、C+AA组、F组和F+AA组，C组为C57BL/6J小鼠骨折手术后每天给予生理盐水灌胃;C+AA组:C57BL/6J小鼠骨折手术后每天给予AA油剂灌胃(6g/kg);F组:fat-1转基因小鼠骨折手术后每天给予生理盐水灌胃;F+AA组:fat-1转基因小鼠骨折手术后每天给予AA油剂灌胃(6g/kg)。
　　 5.塞来昔布抑制AA代谢通路的环氧合酶(COX)途径，减少前列腺素E2(PGE2)产生
　　 AA代谢通路的COX途径参与骨折愈合中软骨内骨化的调节，COX-2抑制剂塞来昔布(celecoxib)，抑制COX途径，减少PGE2产生。实验小鼠分为2组，即F组和F+Cel组，F组:fat-1转基因小鼠骨折手术后每天给予生理盐水灌胃;F+Cel组:fat-1转基因小鼠骨折手术后每天给予塞来昔布灌胃(50mg/kg)。
　　 6.数据统计分析
　　 实验数据均用SPSS13.0统计软件处理。
　　 四、研究结果:
　　 1.n-3PUFAs通过促进骨折愈合，加速骨痂塑型，对骨折愈合是有益的
　　 与野生型C57BL/6J小鼠(WT)不同，fat-1转基因小鼠(Fat-1)内源性增加n-3PUFAs。骨折愈合早期组织学观察表明，Fat-1较WT的软骨细胞成熟肥大、终末期分化和基质钙化更快。与WT相比，Fat-1的软骨内骨化和骨折愈合更快，骨痂塑型明显更好，形成的板层骨更厚。以上组织学观察表明，Fat-1骨折愈合和骨塑型更早更快。
　　 骨折愈合过程中系列X线观察显示，WT分别在术后21天和28天显示钙化骨痂和骨性愈合，而Fat-1提前至术后18天和21天形成钙化骨痂和达到骨性愈合，表明Fat-1骨折愈合早期软骨内骨化过程较WT快，提前达到骨性愈合。WT于骨折术后35天仅显示有限骨塑型，而Fat-1在骨折术后35天几乎完成骨塑型，表明Fat-1骨折塑型较对照组更快更明显，
　　 softX-ray分析显示，WT和Fat-1在骨折后14天骨痂直径均达到最大，随后逐渐缩小，骨折愈合时间线一致。两组各选12只小鼠于骨折术后21天进行softX-ray摄片，进行两组骨折愈合情况对比分析，再次证实Fat-1骨折愈合较WT更快。
　　 micro-CT骨痂三维重建显示，骨折后49天，WT骨痂塑型不明显，体积大，以编织骨为主，而Fat-1骨痂钙化及骨痂塑型更好，形成完整板层骨，表明Fat-1骨折愈合中软骨内骨化过程较WT快，提前达到骨性愈合，且Fat-1编织骨向板层骨的转化较WT更早更快。
　　 2.n-3PUFAs改变n-6/n-3PUFAs比率，通过AA代谢通路，促进骨折愈合
　　 骨折愈合早期组织学观察，通过C+AA组与C组比较、F+AA组与F组比较发现，外源性AA可促进骨痂中骨髓基质细胞增殖，并促进其向软骨细胞分化，但对软骨细胞成熟肥大、终末期分化起抑制作用，抑制软骨内骨化。F组与C+AA组比较发现，F组内源性减少AA且增加n-3PUFAs，降低n-6/n-3PUFAs比率，可促进软骨细胞终末期分化、基质钙化，加速软骨内骨化;C+AA组外源性增加AA，增加n-6/n-3PUFAs比率，抑制软骨细胞成熟肥大、终末期分化、基质钙化，抑制软骨内骨化，表明n-6/n-3PUFAs比率对软骨内骨化起负调节作用。
　　 骨折术后7、10、14、18、21、28、35天系列X线摄片观察，以及骨折后21天及49天softX-ray观察，通过C+AA组与C组比较、F+AA组与F组比较发现，外源性AA可抑制软骨内骨化，减慢骨折愈合和骨痂塑型。F组与C+AA组比较发现，F组内源性减少AA且增加n-3PUFAs，降低n-6/n-3PUFAs比率，可加速软骨内骨化和骨塑型，促进骨折愈合;C+AA组外源性增加AA，增加n-6/n-3PUFAs比率，抑制软骨内骨化过程，骨塑型减慢，表明n-6/n-3PUFAs比率对骨折愈合及骨塑型起负调节作用。
　　 骨折后49天micro-CT骨痂三维重建对比观察，通过C+AA组与C组比较、F+AA组与F组比较发现，外源性AA可抑制骨痂塑型。F组与C+AA组比较发现，F组内源性减少AA且增加n-3PUFAs，降低n-6/n-3PUFAs比率，可加速骨塑型，促进骨折愈合;C+AA组外源性增加AA，增加n-6/n-3PUFAs比率，骨塑型减慢，表明n-6/n-3PUFAs比率对骨塑型起负调节作用。
　　 以上组织学及影像学结果分析表明，n-3PUFAs促进骨折愈合的机制之一，可能通过改变细胞膜n-6/n-3PUFAs比率，减少AA代谢通路的底物AA，从而加速软骨内骨化而促进骨折愈合。n-6/n-3PUFAs比率对软骨内骨化、骨折愈合及骨塑型起负调节作用。
　　 骨折愈合早期组织学观察，通过F+Cel组与F组比较发现，F+Cel组中塞来昔布抑制环氧合酶-2(COX-2)，减少PGE2产生，骨髓基质细胞初期分化成软骨细胞较对照组明显减少，形成较小骨痂，表明COX途径在骨折愈合早期软骨细胞初期分化中起着重要作用。
　　 骨折术后7、10、14、18、21、28、35天系列X线摄片观察，骨折后21天及49天softX-ray观察，以及骨折后49天micro-CT观察，通过F+Cel组与F组比较发现，F+Cel组塞来昔布对骨折愈合早期软骨内骨化有很明显的影响，形成骨痂较小，但软骨细胞终末期分化和基质钙化加快，骨痂塑型好，表明COX途径对软骨细胞终末期分化、基质钙化以及骨塑型的影响不大。
　　 以上组织学及影像学结果分析表明，塞来昔布抑制COX-2，减少PGE2产生，骨髓基质细胞初期分化成软骨细胞较对照组明显减少，形成较小骨痂，对骨折愈合早期软骨内骨化有明显影响，但对软骨细胞终末期分化、基质钙化以及骨塑型的影响不大，表明COX途径参与骨折愈合早期的调节。
　　 五、结论:
　　 1.本研究通过建立小鼠闭合性股骨骨折模型，与野生型小鼠比较发现，fat-1转基因小鼠内源性产生的n-3PUFAs可促进骨折愈合与骨塑型，表明n-3PUFAs通过加速软骨内骨化而促进骨折愈合与骨塑型，对骨折愈合是有益的。
　　 2.增加AA可增加n-6/n-3PUFAs比率，抑制软骨内骨化，骨塑型减慢，而减少AA或增加n-3PUFAs可降低n-6/n-3PUFAs比率，促进软骨内骨化和骨塑型，表明n-6/n-3PUFAs比率对软骨内骨化、骨折愈合及骨塑型起负调节作用。
　　 3.n-3PUFAs促进骨折愈合的机制之一，是降低细胞膜n-6/n-3PUFAs比率，通过AA代谢通路，加速软骨内骨化与骨塑型。

目录

摘要

第一章 小鼠闭合性股骨骨折模型的建立

1．1 前言

1．2 材料和方法

1．2．1 实验动物与材料

1．2．2 小鼠股骨解剖

1．2．3 骨折造模架

1．2．4 小鼠股骨骨折模型建立

1．2．5 X线观察

1．2．6 soft X-ray摄片

1．2．7 组织学观察

1．2．8 统计软件和统计方法

1．3 实验结果

1．3．1 动物观察

1．3．2 X线观察

1．3．3 soft X-ray观察

1．3．4 组织学观察

1．4 讨论

1．4．1 小鼠股骨骨折模型的价值

1．4．2 小鼠骨骼解剖结构对骨折模型的影响

1．4．3 小鼠骨折模型中内固定方式对骨折愈合的影响

1．5 参考文献

第二章 n-3多不饱和脂肪酸与骨代谢

2．1 前言

2．2 n-3多不饱和脂肪酸

2．3 n-3多不饱和脂肪酸对骨代谢起有益作用

2．3．1 n-3多不饱和脂肪酸对人骨骼健康是有益的。

2．3．2 n-3多不饱和脂肪酸对大鼠骨代谢起有益作用

2．3．3 n-3多不饱和脂肪酸对小鼠骨代谢起有益作用

2．4 n-3多不饱和脂肪酸对骨代谢的作用机制

2．5 n-3多不饱和脂肪酸影响骨折愈合

2．6 参考文献

第三章 n-3多不饱和脂肪酸促进骨折愈合

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验动物

3．2．2 实验材料

3．2．3 溶液配制

3．2．4 实验方法

3．2．5 统计软件和统计方法

3．3 实验结果

3．3．1 fat-1转基因小鼠鉴定结果

3．3．2 动物观察

3．3．3 组织学观察

3．3．4 X线观察

3．3．5 soft X-ray分析

3．3．6 micro-CT检测

3．4 讨论

3．5 参考文献

第四章 n-3多不饱和脂肪酸促进骨折愈合机制的初步研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．3 实验结果

4．3．1 脂肪酸气相色谱分析结果

4．3．1 组织学观察

4．3．2 X线观察

4．3．3 soft X-ray观察

4．3．4 micro-CT检测

4．4 讨论

4．4．1 AA代谢通路参与软骨内骨化而影响骨折愈合

4．4．2 AA代谢通路的COX途径参与软骨内骨化的调节。

4．4．3 n-3多不饱和脂肪酸的临床应用

4．5 参考文献

附录

成果

致谢

声明

统计学证明