Ras/Raf/Erk1/2信号通路过度表达与自闭症的相关性研究

摘要

研究背景和目的:
　　 自闭症也称孤独症，是较严重的全面性精神发育障碍性疾病，和遗传有一定关系，但是致病基因尚未被查出，因此临床诊断困难，而且无法治愈。自闭症的诊断标准主要包括其核心行为症狀:(1)社会关系障碍;(2)语言沟通障碍;(3)兴趣狭窄和刻板重复动作[1]。男女患病率比例为4:1[2]。亚洲、欧洲和北美地区确诊患病率约0.6％-1％[3，4，5，6]。我国尚无全国大规模的的流行病学调查，估计婴幼儿发病率约0.4％左右[7，8]。在过去20年内，欧洲、美国的自闭症发病率上升5-10倍[9，10]。一些药物用于治疗自闭症，但效果欠佳[11]，主要依靠行为治疗改善患者的社交及语言交流能力[12]。英国每年用于治疗自闭症儿童的费用达2.7亿英镑[13]，美国每个自闭症儿童早期医疗服务的每年开支是35，000美元[14]，对社会及家庭造成沉重的精神及经济负担，使自闭症成为重要的公共健康问题。
　　 自闭症病因尚不清楚，过去曾经认为，其病因可能与社会心理因素有关，但目前普遍认为是多因素导致，主要包括遗传、环境因素[15,16,17,18]。10％到20％自闭症患者存在染色体异常情况，目前已知的相关染色体有7q、22q13、2q37、18q、Xp[19]。细胞遗传学研究发现常见的自闭症易感基因包括:NLGNS(NLGN1，NLGN3,andNLGN4X),MECP2、FMR1、TSC1/2、SHANK3、CNTNAP2等[20,21,22,23]，提示孤独症是一种多基因遗传病。
　　 有学者猜测具有携带自闭症易感基因背景者，暴露于危险环境因子[24,25]，发病率明显升高[26]。主要致病因子包括:汞，镉，镍，三氯乙烯，氯乙烯[27]，尤其在妊娠期或围产期暴露[28]。研究发现胚胎发育早期，即受精后20至40天的器官形成期为自闭症发病的易感期。如果在此期间胚胎受药物、重金属或母体不良状况等宫内环境因素的影响，胚胎未来发生自闭症的风险显著升高。产前暴露于“丙戊酸”、“乙醇”、“沙利度胺”和“米索前列醇”，可导致子代患自闭症的机率增加[29]。早于1943年LeoKanner首次发现11名1岁的儿童表现出“情感接触中孤独性障碍”时，就推测自闭症可能来源于产前[30]。最新研究表明当婴儿出生时体重低于正常婴儿体重时，其患上自闭症的几率比正常体重的婴儿高出5倍[31]。在先天异常与环境因素相互作用下，自闭症患者的临床症状加重，或许由于遗传脆弱性，神经系统更容易达到自闭症的发病“门槛”[32]。
　　 最近有研究发现16号染色体缺失与自闭症相关，而编码ERK1蛋白的MAPK3基因位于16号染色体[33]。Erk2所在的22q11.2缺失也与自闭症发病相关[105，106]。MAPK基因位于22q1.3DGS区，许多患者的这个区域缺失，导致一系列的心脏、皮肤、神经系统异常[105-108]，临床病例研究发现部分自闭症患者存在22q11.2缺失和重复，提示22q11.2可能与自闭症相关研究结果表明，MAPK级联不同元素的的单倍剂量不足可以导致类似的解剖异常和智力障碍。越来越多研究表明自闭症可能与神经细胞凋亡有关。Ras/Raf/Erk1/2信号通路促进神经细胞凋亡。我们前期研究也发现自闭症患者及自闭症模型小鼠BTBRT+tf/J(BTBR)的大脑皮质中Ras/Raf/Erk1/2信号通路蛋白表达异常升高[34，35]，Mek抑制剂U0126可抑制BTBR小鼠大脑皮质细胞Ras/Raf/Erk1/2信号通路过度上调，部分纠正BTBR小鼠大脑皮质神经细胞各种异常行为，进一步验证Ras/Raf/Erk1/2信号通路可能参与自闭症的发病过程。
　　 BTBR是一种近交系小鼠，具有自闭症的三大核心症状:社交减少、社交场合中话语少、重度的重反复理毛行为[36-38]。BTBR小鼠也是唯一一种具备所有自闭症的行为的品系。最近研究发现BTBR小鼠DISC1基因上有25对碱基对缺失，而DISC1证实是精神障碍疾病的易感基因，包括精神分裂症、自闭症[39]。因此，BTBR小鼠是目前研究自闭症的理想模型。
　　 U0126（1,4-二氨基-2，3-氰基-1,4-双[2-氨基苯基硫代]丁二烯）是有丝分裂原激活蛋白激酶激酶1/2(Mek1/2)抑制剂，能抑制细胞迁移、侵袭、黏附、转移、mRNA表达及蛋白激活，例如MMP-1，MMP-2，MMP-9和MT1-MMP[40]。已被用于在体内和体外研究[41]。
　　 我们前期试验发现2周大小的BTBR小鼠大脑皮质Ras/Raf/Erk1/2信号通路异常上调，但Ras/Raf/Erk1/2信号通路异常上调与时间关系尚不清楚。本实验以BTBR小鼠为自闭症模型，应用WesternBlot检测不同年龄的BTBR小鼠大脑中Ras/Raf/Erk1/2信号通路的表达情况，探讨自闭症Ras/Raf/Erk1/2的异常表达情况及起始时间点。
　　 根据Ras/Raf/Erk1/2信号通路异常表达的开始时间，应用Mek抑制剂降低BTBR小鼠中Erk及Mek的磷酸化水平，然后进行行为学测试，探讨Ras/Raf/Erk1/2信号通路与自闭症的异常行为的影响作用，免疫荧光检测小鼠大脑皮质区、海马CA1及CA3区中VGLUT1/VGAT比值、Map2和PSD-95的表达情况，DiI染色检测神经元成熟树突棘的形成情况，进一步探讨Ras/Raf/Erk1/2信号通路与自闭症的发病关系。
　　 方法:
　　 1、WesternBlot检测不同年龄的BTBR小鼠大脑中Ras/Raf/Erk1/2信号通路的表达情况
　　 分别解剖新生、3周、6周大小的BTBRT+tfJ小鼠及其相对应年龄的C57BL/6(B6)小鼠的大脑组织，进行蛋白匀浆，应用WesternBlot检测每个年龄段大脑组织中Ras/Raf/Erk1/2信号通路中各成员的磷酸化蛋白表达情况(包括P-A-Raf、P-B-Raf、P-C-Raf、P-Erk1/2、P-Mek1/2)。
　　 2、Mek1/2抑制剂U0126治疗BTBR小鼠
　　 应用Mek1/2抑制剂U0126治疗BTBR小鼠，从出生3天开始，400μg/kg，腹腔注射，每天1次，连续3周。对照组包括相应年龄的BTBR小鼠及B6小鼠，予以相应剂量的40％DMSO腹腔注射，每天1次，连续3周。应用WesternBlot检测Mek1/2抑制剂对P-Mek1/2及P-Erk1/2的抑制情况，初步评价治疗效果。
　　 3、行为学实验检测Mek1/2抑制剂治疗后对BTBR小鼠异常行为的影响情况
　　 根据实验对动物造成压力从轻到重的顺序，应用社交活动实验、高架十字迷宫实验、明暗穿箱实验、旷场实验、埋珠实验、恐惧制约实验分别检测Mek1/2抑制剂治疗后对BTBR小鼠社交行为、焦虑情况、自发活动、重复与刻板动作、记忆能力的影响。实验安排见表1:
　　 两个实验间需间隔2-3天。
　　 4、免疫荧光检测Mek1/2抑制剂对BTBR小鼠神经系统VGLUT1/VGAT比值、Map2和PSD-95表达情况的影响
　　 BTBR小鼠及B6小鼠接受U0126DMSO治疗3周后，取其大脑组织固定后冰冻切片，免疫荧光技术检测小鼠大脑皮质区、海马CA1及CA3区中VGLUT1、VGAT、Map2和PSD-95的表达情况，拍摄条件一致下应用Z-stack叠加拍片，ImageJ图像软件分析荧光强度，每组6个切片，每个功能区域随机数10个细胞，共计数60个神经细胞。
　　 5、DiI染色检测Mek1/2抑制剂对BTBR小鼠神经元成熟树突棘的形成的影响
　　 BTBR小鼠及B6小鼠接受U0126DMSO治疗3周后，取其大脑组织固定后振荡切片，Vybrant-DiIcell-labeling孵育36小时后浸洗、封片。一周内应用共聚焦显微镜Z-stack叠加拍片;每组3只小鼠，每只小鼠计数3-4个神经元，每组共计算9-12个树突棘。
　　 6、统计方法
　　 应用SPSS13.0软件进行数据分析，两组间的蛋白表达水平比较应用两样本t检验。三组间的蛋白表达水平比较应用方差分析。社交活动实验中三组小鼠三个房间的停留时间、进入次数、嗅的时间比较应用重复测量的方差分析，自梳理及静止时间应用方差分析;高架十字迷宫中三组间开臂时间应用方差分析;明暗穿箱实验中三组间明箱停留时间、进入次数应用方差分析;旷场实验中自梳理时间、面壁站立时间及非活动时间应用方差分析;埋珠实验中被掩埋珠子的数量应用方差分析;恐惧制约实验中三组间的凝滞时间应用方差分析;三组间免疫荧光强度、成熟突触数目比较采用方差分析。先进行方差齐性检验，方差不齐时用Welch校正;组间多重比较，方差齐性时采用LSD法，方差不齐时采用DunnettT3法。所有数据表示为均数±标准误，P值＜0.05有统计学差异。
　　 结果:
　　 1、BTBR小鼠大脑组织Ras/Raf/Erk1/2信号通路的异常表达时间
　　 与B6小鼠相比，BTBR小鼠大脑组织中P-B-Raf、P-C-Raf、P-Mek1/2、P-Erk1/2的条带更强，其平均表达量均升高(P-B-Raf:t=7.192，P＜0.001;P-C-Raf:t=2.661，P=0.024;P-Mek1/2:t=8.912,P＜0.001;P-Erk1/2:t=3.733,P=0.004)，其中P-Mek1/2升高最明显，达5.318倍。3周龄大小BTBR小鼠及B6小鼠脑组织中P-B-Raf、P-C-Raf、P-Mek1/2、P-Erk1/2蛋白表达水平未见统计学差异(P-B-Raf:t=1.663,P=0.127;P-C-Raf:t=1.019,P=0.332;P-Mek1/2:t=2.188,P=0.053;P-Erk1/2:t=1.341，P=0.210)。与B6小鼠相比，6周龄大小BTBR小鼠各蛋白的表达量未见异常升高(P-B-Raf:t=2.127，P=0.059;P-C-Raf:t=0.394，P=0.702;P-Mek1/2:t=0.961,P=0.359;P-Erk1/2:t=0.916,P=0.381)。
　　 2、Mek1/2抑制剂对P-Erk1/2蛋白的抑制作用
　　 应用Mek1/2抑制剂U0126连续治疗3周后，WesternBlot检测BTBRU0126、BTBRDMSO、B6DMSO三组间脑组织的P-Erk1/2表达水平发现三组间有显著性差异(F=6.398，P=0.010)。BTBRU0126组的P-Erk1/2蛋白条带较BTBRDMSO组弱，相对表达量下降约47％(F=3.175,P=0.010)。而B6DMSO组的相对表达量与BTBRDMSO组间没有显著性差异(F=1.342,P=0.209)。
　　 3、Mek1/2抑制剂(U0126)对BTBR小鼠行为的影响
　　 3.1.Mek1/2抑制剂(U0126)对BTBR小鼠社交行为的影响
　　 社交行为测试学实验发现，社交(Sociability)阶段三组停留在陌生小鼠房间(strangerchamber)的时间比空铁杯房间(novelobjectchamber)更多(F=18.124，P=0.001)。B6DMSO组停留在陌生小鼠房间(strangerchamber)的时间与空铁杯房间有统计学差异(F=8.383,P=0.015)，但是BTBRU0126组、BTBRDMSO组在陌生小鼠房间的时间与空铁杯房间时间没有统计学差异(F=2.513，P=0.141;F=1.635，P=0.227)。三组在陌生小鼠房间嗅的时间与空铁杯房间的时间有统计学差异(F=15.201,P=0.000)，B6DMSO组、BTBRU0126在陌生小鼠房间嗅的时间与空铁杯房间的时间有统计学差异(F=9.598，P=0.010;F=6.783，P=0.024)，而BTBRDMSO组没有统计学差异(F=1.693，P=0.220)。
　　 3.2.Mek1/2抑制剂(U0126)对BTBR小鼠焦虑情绪的影响
　　 高架十字迷宫试验测试结果显示三组间的开臂停留时间有统计学差异(F=3.607,P=0.038)，但是BTBRU0126组与BTBRDMSO组没有统计学差异(P=0.159)。明暗穿箱实验试验结果显示三组间的明箱(lightbox)停留时间百分比有统计学差异(F=26.219,P=0.000)，但是BTBRU0126和BTBRDMSO组间没有统计学差异（F=0.902,P=0.377）。三组间的明箱进入次数有统计学差异(F=7.658,P=0.026)，B6组和BTBRDMSO组有统计学差异(P=0.009)，但B6组和BTBRU0126组、BTBRU0126和BTBRDMSO组间没有统计学差异(P=0.0.056;P=0.435)。
　　 3.3.Mek1/2抑制剂(U0126)对BTBR小鼠重复刻板动作的影响
　　 应用埋珠实验检测小鼠的重复刻板动作情况，计算每组掩埋1/2以上的大理石个数，发现三组间掩埋的大理石球没有统计学差异(F=2.940，P=0.067)。社交行为测试学习惯阶段及社交阶段三组间的自梳理时间均有显著性差异(F=15.526，P=0.000;F=0.888，P=0.000），但BTBRU0126组、BTBRDMSO组没有显著性差异(P=0.219;P=0.596)。旷场实验三组间的自梳理时间(Groomingtime)有统计学意义(F=9.649，P=0.001)，但是BTBRU0126组与BTBRDMSO组没有统计学差异(P=0.195)。
　　 3.4.Mek1/2抑制剂(U0126)对BTBR小鼠自发活动情况的影响
　　 应用旷场实验检测动物的自发活动情况，结果显示三组间的非活动时间(immobiletime)有统计学差异(F=11.694，P＜0.001)，两两之间比较发现BTBRU0126组与BTBRDMSO组有统计学差异(P=0.026)。三组间的面壁站立时间(rearingtime)有统计学意义(F=9.134，P=0.001)，但是BTBRU0126组与BTBRDMSO组没有统计学差异(P=0.198)。三组间的中央停留时间百分比(％centertime)有统计学意义(F=15.780，P＜0.001)，但是BTBRU0126组与BTBRDMSO组没有统计学差异(P=0.665)。
　　 3.5.Mek1/2抑制剂(U0126)对BTBR小鼠记忆力的影响
　　 条件恐实验主要用于测试动物的记忆能力，结果显示三组间基本的凝滞时间没有统计学差异(F=0.654，P=0.526)，训练后三组间的凝滞时间没有统计学差异(F=0.378，P=0.688);关联阶段(context)三组间的凝滞时间有统计学差异(F=3.404，P=0.045)，BTBRU0126组与BTBRDMSO组没有统计学差异(P=0.656)，B6DMSO组与BTBRDMSO组间有统计学差异(P=0.020)，但是B6DMSO组与BTBRU0126组间没有统计学差异(P=0.054)。变更关联阶段(cue)三组间的凝滞时间有统计学差异(F=12.163，P＜0.001)，BTBRU0126组与BTBRDMSO组没有统计学差异(P=0.825)。
　　 4、Mek1/2抑制剂(U0126)对大脑神经系统VGLUTI/VGAT比值、Map2和PSD的影响
　　 4.1.Mek1/2抑制剂(U0126)对大脑神经系统VGLUTI/VGAT比值的影响
　　 结果显示海马CA1区三组间的VGLUTI/VGAT比值有显著性差异(F=14.534,P＜0.001)，B6DMSO和BTBRU0126间有显著性差异(P=0.021)，BTBRU0126和BTBRDMSO间有显著性差异（P=0.003），荧光强度下降24.234％，B6DMSO和BTBRDMSO间有显著性差异(P＜0.001)，BTBRDMSO的VGLUTI/VGAT比值是B6DMSO的1.748倍。海马CA3区三组间的VGLUTI/VGAT比值VGLUTI/VGAT比值没有显著性差异(F=2.236，P=0.110)。大脑皮质区三组间的VGLUTI/VGAT比值没有显著性差异(F=0.330，P=0.720)。
　　 4.2.Mek1/2抑制剂(U0126)对大脑神经系统MAP2表达的影响
　　 结果显示海马CA1区三组间MAP2荧光强度有显著性差异(F=89.680,P＜0.001)，B6DMSO和BTBRU0126间有显著性差异(P＜0.001)，BTBRU0126和BTBRDMSO间有显著性差异(P＜0.001)，B6DMSO和BTBRDMSO间没有显著性差异(P=0.139)。海马CA3区三组间的MAP2荧光强度有显著性差异(F=151.246，＜0.001)，B6DMSO和BTBRU0126间有显著性差异(P＜0.001)，BTBRU0126和BTBRDMSO间有显著性差异(P＜0.001)，B6DMSO和BTBRDMSO间没有显著性差异(P=0.139)。三组小鼠的大脑皮质区MAP2荧光强度弱，无法检测。
　　 4.3.Mek1/2抑制剂(U0126)对大脑神经系统PSD的影响
　　 结果显示海马CA1区三组间PSD荧光强度有显著性差异(F=4.963，P=0.008)，B6DMSO和BTBRU0126间没有显著性差异(P=0.930)，BTBRU0126和BTBRDMSO间有显著性差异(P=0.006)，B6DMSO和BTBRDMSO间有显著性差异(P=0.008)。海马CA3区三组间的PSD荧光强度没有显著性差异(F=0.621，P=0.539)。大脑皮质区三组间PSD荧光强度有显著性差异(F=54.489,P＜0.001)，B6DMSO和BTBRU0126间有显著性差异(P＜0.001)，BTBRU0126和BTBRDMSO间有显著性差异(P＜0.001)，B6DMSO和BTBRDMSO间没有显著性差异(P＜0.001)。
　　 5.Mek1/2抑制剂(U0126)对大脑皮质成熟树突棘形成的影响
　　 应用DiI标记检测B6DMSO、BTBRU0126和BTBRDMSO三组小鼠大脑组织中的树突棘的形态。染色结果提示，使用U01261治疗后，BTBR皮质区成熟树突棘密度是BTBR未处理组的2倍(P=0.024)，但仍低于B6DMSO组(B6DMSOVSBTBRU0126:P=0.002;B6DMSOVSBTBRDMSO:P＜0.001)
　　 结论
　　 1.应用WesternBlot检测不同年龄的BTBR小鼠大脑中Erk1/2信号通路的表达情况，发现新生鼠的Erk1/2信号通路表达明显升高，3周时表达水平与B6相当，一直持续到成年。
　　 2.Mek抑制剂对新生小鼠进行腹腔注射，下调BTBR小鼠大脑的ERK磷酸化水平，行为学检查发现Mek抑制剂能部分改善BTBR小鼠的社交能力及自发活动，但焦虑症状、重复刻板动作、学习记忆能力未见明显改变。
　　 3.Mek1/2抑制剂下降Erk1/2活化水平阻碍海马CA1区兴奋性突触的形成，并刺激抑制性突触的发育，调节兴奋性/抑制性神经细胞比例;上调BTBR小鼠的海马CA1、CA3区Map2表达水平;上调BTBR小鼠的海马CA1区、大脑皮质区的PSD表达。
　　 4.Mek抑制剂促进BTBR小鼠大脑皮质区的树突棘成熟。

目录

摘要

前言

一、自闭症的研究进展

二、Ras／Raf／Erkl／2信号通路的研究进展及其与白闭症的关系

三、BTBR T+tf／J(BTBR)小鼠的应用情况

四、本课题的研究思路

技术路线

第一章 Ras／Raf／Erkl／2信号通路在BTBR小鼠脑组织中的表达情况与时间关系

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第二章 Mek抑制剂治疗对BTBR小鼠生物学行为的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第三章 Mek抑制剂U0126对BTBR小鼠突触相关蛋白的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文小结

攻读学位期间发表的论文

致谢

声明