RNA干扰诱导CD147基因沉默稳定动脉粥样硬化易损斑块的研究

摘要

背景：
　　 目前认为动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)斑块表面破裂形成血栓和动脉闭塞是引起急性冠脉综合征(AcuteCoronarySyndromes，ACS)的主要病理基础和发病机制，而AS斑块从稳定变为易损的过程涉及到炎症、免疫、代谢、凝血等多个环节，其中AS斑块内覆盖脂质中心的纤维帽厚度、强度及其胶原组织含量的多少是决定斑块稳定与否至关重要的因素。纤维帽的重要成分为细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)，其主要成分为纤维结构蛋白、蛋白多糖等。纤维帽越厚，胶原纤维含量越多，斑块越不容易破裂。因此，纤维帽的破裂与纤维帽ECM含量的减少密切相关。基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinase，MMPs)是降解ECM最重要的酶类，通过降解ECM，使AS斑块由“稳定斑块”向“不稳定斑块”转变，从而诱发斑块破裂，导致急性冠脉综合征。
　　 CD147分子在人体内的命名为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(ExtracellularMatrixMetalloproteinaseInducer,EMMPRIN)，又称为basigin、M6、Neurothelin，早期是从肺癌细胞系LX-1中被分离出来，是一种高度糖基化的、广泛表达于造血及非造血细胞系的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。研究发现CD147可以在平滑肌细胞、内皮细胞、单核细胞等多种细胞中诱导金属基质蛋白酶的产生，其包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、1型跨膜基质金属蛋白酶蛋白(MembraneType1MatrixMetalloproteinase，MT-MMP)等，由此我们推测斑块内CD147通过影响MMPs的表达，对斑块稳定性可能起到重要作用。
　　 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指将外源性或内源性的dsRNA(doublestrandedRNA，dsRNA)导入细胞后，引起与其同源的mRNA发生特异性降解，导致基因不表达，由于dsRNA可以抑制不同类型的靶向基因表达，因此RNAi技术也被形象地称为基因敲除(knockout)或基因沉默(genesilencing)。RNAi技术是目前简单而高效阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法，因为发生在转录后水平，所以又称转录后基因沉默(PostTranscriptionalGeneSilencing，PTGS)。但随着研究的深入，人们发现RNAi的作用不仅是在转录后水平，在转录和翻译等多个不同的水平也能实现。dsRNA在体内引起RNA干扰的过程大致可以分为以下2个阶段:长链的dsRNA被Dicer(一种具有人1RnaseⅢ样活性的核酸酶)识别并加工成具有21-23个核苷酸的小干扰RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)，随后这些双链siRNA结合到1种蛋白复合物中形成RNA介导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingproteincomplex，RISC）;RISC中的螺旋酶解开双链siRNA，后者通过解开的反义链与和siRNA具有高度互补序列的mRNA结合，并引导siRNA结合mRNA。随后siRNA与mRNA在复合体中换位，核酸酶Dicer将mRNA切割成21-23个核苷酸的片段，特异性地抑制靶基因的表达。而新产生的双链RNA片段可再次形成RISC复合物，继续降解mRNA，从而产生级联放大效应，因此，每个细胞只需要几个siRNA分子就可以引起强烈的RNAi效应。
　　 目前尽管已成功应用许多措施防治或减少冠心病的发生发展，如溶栓、降脂等疗法，但对于易损或破裂斑块的防治作用仍然很有限，如何稳定易损斑块依旧是目前ACS防治的瓶颈与难点。近年来，随着RNAi技术在心血管病方面已表现出传统治疗方法所无法比拟的优越性，人们认识到能否通过RNAi技术来稳定动脉硬化斑块，为心血管疾病的治疗开辟了新途径。而随着动脉粥样硬化不稳定斑块机制的研究深入，发现MMPs及CD147分子在AS不稳定斑块的发展中发挥着重要作用，抑制MMPs和CD147表达和活性升高能否成为稳定斑块，防止冠状动脉事件的治疗策略的新靶点，而采用RNA干扰技术沉默相关基因更具有广泛的应用前景。
　　 第一部分，CD147慢病毒载体对兔外周血单核巨噬细胞的沉默作用
　　 目的：
　　 CD147在人体内命名为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子，通过影响平滑肌细胞、内皮细胞、单核-巨噬细胞等多种细胞内MMPs的表达，对斑块稳定性可能起到重要作用。通过设计、合成并构建抑制CD147基因表达的短链RNA(shortinterferingRNA，shRNA)慢病表达载体，并在体外筛选出能高效抑制兔外周血单核巨噬细胞中CD147表达的有效载体。
　　 方法：
　　 1、兔外周血单核细胞分离培养采集兔子动脉肝素抗凝血(20U/ml全血)，加等量PBS液1:1比例稀释混匀。在15ml离心管底部加入单核细胞分离液6ml，将肝素抗凝血与等量PBS液叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面，水平离心。用尖吸管缓慢插到第二层界面的云雾层，分离单个核细胞。加入5倍以上体积的预热的PBS液，离心、洗涤。末次离心后，弃上清，接种于50ml培养瓶，37℃，5％CO2培养箱培养2h后吸出培养基，用预热的RPMI1640液清洗3遍，将未贴壁细胞洗脱，剩下的贴壁细胞即为单核细胞。
　　 2、诱导外周血单核细胞到巨噬细胞待上述细胞静止12h后，换入含佛波酯的RPMI-1640完全培养基，刺激48h使之转化为巨噬细胞。
　　 3、实验分6组:①空白对照组:仅加入Polybrene2μl，不做任何处理;②NC对照组:加入NC慢病毒载体0.1ml+Polybrene2μl;③慢病毒干扰组(A、B、C、D组):分别加入BSG-836、BSG-311、BSG-191、BSG-859慢病毒载体0.1ml+Polybrene2μl每组设3个重复。
　　 4、72h后通过荧光显微镜观察转染效果，并收集细胞和细胞上清液，分别行RT-PCR及ELISA检测，观察RNAi对CD147mRNA和蛋白表达的下调作用，并检测细胞上清液中MMP-2、MMP-9蛋白的分泌情况。
　　 5、统计学处理:所得数据应用SPSS13.0软件进行统计学描述与分析，计量资料用(x)±s（均数±标准差）表示，若总体方差齐时，多组样本均数比较采用One-wayANOVA，多重比较应用LSD法检验。总体方差不齐时，采用多个独立样本非参数分析Kruskal-WallisH检验，两两组间比较应用Dunnett'sT3法检验。P＜0.05认为有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、RT-PCR检测各组CD147mRNA表达结果:各组均可检测到CD147mRNA表达，组间存在显著性差异(F=51.420，P=0.000)。空白对照组、NC对照组的CD147mRNA表达水平无差异(P=0.796);慢病毒干扰各组(A-D组)mRNA表达水平显著低于空白对照组(P=0.000)，其中A组mRNA降低最为显著，较空白对照组下调57.72％(P=0.000)
　　 2、ELISA检测各组CD147蛋白表达及结果:各组均可检测到CD147蛋白表达，组间存在显著性差异(F=18.423，P=0.000)。空白对照组、NC对照组CD147蛋白表达无显著差异(P=0.640)。空白对照组及NC对照组CD147蛋白表达无显著差异(P=0.640)。慢病毒干扰组（A-D组）与空白对照组相比CD147蛋白表达量显著降低(P值依次为P=0.000，P=0.000，P=0.001，P=0.000)，其中A组CD147蛋白表达降低最为显著，较空白对照组下调42.40％(P=0.000)。
　　 3、各组MMP-2、MMP-9蛋白表达:各组均可检测到MMP-2、MMP-9蛋白表达，组间均数有显著性差异（分别为F=206.012，P=0.000;F=9.385，P=0.001）。各组间的多重比较，空白对照组、NC对照组、MMP-2、MMP-9蛋白表达量无显著差异（分别为P=1.000;P=0.632）。慢病毒干扰组（A-D组）与空白对照组相比MMP-2、MMP-9表达量显著降低，A组MMP-2、MMP-9蛋白表达与空白对照组及NC对照组相比下降最明显，差异均具有统计学意义(P=0.014，P=0.003)。
　　 4、单核/巨噬细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达水平与CD147水平的相关性各组MMP-2、MMP-9与CD147水平的相关系数分别为r=0.899，r=0.814，两者与CD147表达水平存在显著正相关，差异具有统计学意义(P=0.000)。
　　 结论：
　　 1、采用单个核细胞分离液密度梯度离心及吸附法成功分离出兔外周血单核细胞。
　　 2、成功设计合成了针对CD147基因的shRNA慢病毒载体，并从中筛选出能特异且高效阻断CD147表达的shRNA。
　　 第二部分，金属基质电白酶诱导因子(CD147)shRNA慢病毒载体稳定动脉粥样硬化粥样斑块的实验研究
　　 目的：
　　 1、利用液氮冻伤术结合高脂饮食喂养创建与人类斑块相似的动脉粥样硬化斑块模型，为易损斑块基础研究及干预治疗研究奠定基础。
　　 2、在上述自创的兔AS破裂斑块模型基础上，利用体外实验所筛选出能高效抑制兔外周血单核巨噬细胞中CD147表达的shRNA慢病毒表达载体，局部侵染兔颈动脉粥样斑块，观察并评价CD147RNAi稳定易损斑块的效果。
　　 方法：
　　 1、动物模型的建立健康纯种雄性新西兰白兔30只，普通饲料适应性喂养3天后，实施右颈总动脉内膜液氮冻伤术，术后高脂饲料喂养10周。
　　 2、局部慢病毒转染液氮冻伤并高脂喂养10周后，随机抽取2只兔子处死，观察斑块情况。根据转染病毒不同，随机分为3组，各组分别命名:①空白对照组(n=8)颈动脉斑块处注射生理盐水;②病毒阴性对照组(n=10)局部注射阴性对照慢病毒载体;③CD147慢病毒干扰组(n=10)于颈动脉斑块局部注射CD147慢病毒表达载体。并于转染4周后，行液氮激发术，观察斑块破裂情况，检测斑块的病理学形态结构。
　　 3、分别于实验前、高脂饲养10周末、病毒干扰4周末及激发48h后采血，检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)，并采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测高敏C反应蛋白(hs-CRP)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶3（MMP-3）、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的水平。激发48h后处死所有动物，取出实验血管作HE染色、Masson三色染色和弹力纤维染色，光镜观察斑块形态学特点。应用NF-(K)、CD147、MMP-2、MMP-9及MMP-14的单克隆抗体对实验血管进行免疫组织化学染色，以明确斑块处各炎性因子及金属基质蛋白酶系列蛋白表达情况。
　　 4、统计学分析:数据应用SPSS13.0软件进行统计学描述与分析，计量资料用均数±标准差表示，两配对样本均数总体比较时采用配对样本t检验。干扰因素与时间主效应和交互效应的比较采用析因设计的方差分析，多个样本均数总体比较采用One-wayANOVA（方差不齐时多个样本均数总体比较采用Brown-Forsythe法检验，对自由度进行校正后在进行比较）;方差齐时多个样本均数间的多重比较采用LSD检验（方差不齐时样本均数间的多重比较采用Dunnett'sT3检验），认为P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、兔总体生长良好。实验过程中共有5只兔死亡，实际用于结果分析的共23只。高脂喂养10周末，可见右侧损伤段右侧颈总动脉形成明显的粥样斑块。液氮冻伤结合高脂喂养10周后血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白3项指标与造模前比较明显升高（t值分别为-42.117，-40.208，-30.293，P值均为0.000）。
　　 2、血清CD147浓度变化:实验前、造模后、慢病毒干扰4周末及液氮激发48h后，同组CD147在血清的表达具有显著性差异(F=66.651，P=0.000)，同一时间点，各组兔CD147水平也存在显著性差异(F=21.849，P=0.000)。时间与干扰因素存在交互效应(F=6.474，P=0.000)。慢病毒干扰4周后，CD147干扰组CD147水平较其它两组明显降低(P=0.000)。液氮激发后48h，空白对照组及NC对照组CD147水平较CD147干扰组明显升高(P=0.000)。
　　 3、血清MMP-1浓度变化:实验前、造模后、慢病毒干扰4周末及液氮激发48h后MMP-1在血清的表达具有显著性差异(F=17.695，P=0.000)，空白对照组、NC对照及CD147慢病毒组各组兔MMP-1水平也存在显著性差异(F=21.849，P=0.000)，时间与干扰因素存在交互效应(F=7.407，P=0.000)。CD147慢病毒组兔的MMP-1浓度在造模后及液氮激发48h后较实验前明显升高(P=0.000;P=0.012)，慢病毒干扰后与造模后相比MMP-1显著降低(P=0.002)，与液氮激发48h后相比差异无统计学意义(P=0.314)。
　　 4、血清MMP-2浓度变化:实验前、造模后、慢病毒干扰4周末及液氮激发48h后MMP-2在血清的表达具有显著性差异(F=66.787，P=0.000)，空白对照组、NC对照及CD147慢病毒组各组兔MMP-2水平也存在显著性差异(F=15.233，P=0.000)，时间与分组存在交互效应(F=7.971，P=0.000)。CD147慢病毒组兔的MMP-2浓度在造模后及液氮激发48h后明显升高(P=0.000;P=0.012)，慢病毒干扰后与造模后相比MMP-2显著降低(P=0.001)，与液氮激发48h后相比差异无统计学意义(P=0.415)。慢病毒干扰4周后及液氮激发48h后，CD147干扰组MMP-2浓度较其他两组明显降低，差异具有统计学意义(P=0.001，P=0.000)。
　　 5、血清MMP-3浓度变化:实验前、造模后、慢病毒干扰4周末及液氮激发48h后MMP-3在血清的表达具有显著性差异(F=61.345，P=0.000)，空白对照组、NC对照及CD147慢病毒组各组兔MMP-3水平也存在显著性差异(F=8.901，P=0.000)，时间与分组存在交互效应(F=8.202，P=0.000)。CD147干扰组血清MMP-3水平造模后较实验前明显升高(P=0.000);慢病毒干扰后4wMMP-3较造模后无明显降低(P=0.481);液氮激发后48hMMP-3较干扰后4w无明显升高(P=0.934)。液氮激发后48h，3组兔血清MMP-3水平存在显著差异(F=16.980，P=0.000)空白对照组及NC对照组MMP-3浓度较CD147干扰组明显升高(P=0.000)。
　　 6、血清MMP-9浓度变化:实验前、造模后、慢病毒干扰4周末及液氮激发48h后CD147在血清的表达具有显著性差异(F=28.399，P=0.000)，空白对照组、NC对照及CD147慢病毒组各组兔MMP-9水平也存在显著性差异(F=123.432，P=0.000)，时间与分组存在交互效应(F=13.609，P=0.000)。CD147干扰组血清MMP-9水平造模后较实验前明显升高(P=0.000);慢病毒干扰后4wMMP-9较造模后明显降低(P=0.004);液氮激发后48hMMP-9较干扰后4w无明显升高(P=0.661)。液氮激发48h后，CD147干扰组MMP-9水平较空白对照组低，且差异具有统计学意义(P=0.000)。
　　 7、血清炎症因子hs-CRP浓度水平的变化:实验前、造模后、慢病毒干扰4周末及液氮激发48h后hs-CRP在血清的表达具有显著性差异(F=1604.86,P=0.000)，空白对照组、NC对照及CD147慢病毒组各组兔hs-CRP水平也存在显著性差异(F=118.582，P=0.000)，时间与分组存在交互效应(F=101.302，P=0.000)。CD147慢病毒组兔的hs-CRP浓度在造模后、病毒干扰后4周及液氮激发48h后明显升高(P=0.000)，慢病毒干扰后与造模后相比hs-CRP无明显升高(P=0.096)，与液氮激发48h后相比，后者明显升高，差异有统计学意义(P=0.000)。慢病毒干扰4周后，CD147干扰组hs-CRP浓度明显低于其他两组，差异具有统计学意义(P=0.000)
　　 结论：
　　 研究结果表明，干扰后4周末CD147干扰组金属基质蛋白酶系列蛋白表达较空白对照及阴性对照组明显降低，液氮激发48h，无明显升高。因此，我们推测在易损斑块的动物模型中，CD147shRNA慢病毒载体能有效沉默CD147基因，对斑块的稳定性可能起着重要的保护作用，有望为急性心脑血管事件的防治开辟一条崭新的途径。

目录

摘要

前言

第一部分 构建金属基质电白酶诱导因子(CD147)慢病毒表达载体

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

参考文献

第二部分 CD147shRNA慢病毒载体稳定动脉粥样硬化易损斑块的实验研究

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

附图

参考文献

英文缩写词

成果

致谢

声明

统计学审稿证明