EphB4受体分子致慢性髓系白血病伊马替尼耐药机制研究

摘要

研究背景:慢性髓系细胞白血病(Chronicmyeloidleukemia，CML)是常见的血液系统恶性肿瘤，其自然病程分为慢性期(chronicphase，CP)、加速期(acceleratephase，AP)和急变期(Blastcrisis，BC)，其特点是具有克隆性的Ph染色体阳性细胞，并表达BCR-ABL融合蛋白P210，该蛋白可以产生持续性的酪氨酸激酶活性并最终造成肿瘤细胞的持续增殖。甲磺酸伊马替尼(imatinib，IM，STI571，格列卫，诺华制药，瑞士)就是可以抑制BCR-ABL融合蛋白激酶活性的靶向药物，它的出现使得CML的细胞遗传学和分子生物学缓解率及长期生存有了显著的改善。随着IM的大量应用，我们逐渐认识到，有相当数量的患者会出现IM耐药，包括原发耐药与继发耐药。一旦患者发生耐药性，往往是二代、甚至三代酪氨酸激酶抑制剂也不能控制病情，或者仅仅可以短期维持，继而病情进展直至死亡。目前，关于IM耐药机制，最为成熟的研究为BCR-ABL激酶区域的点突变，如T315I突变、P-loop突变等。然而，激酶区域点突变并不能完全解释耐药机制，有相当比例的患者并不存在激酶区域的突变，研究发现，BCR-ABL蛋白非激酶区域的功能区异常是导致IM耐受的重要机制之一，越来越多的信号分子被认为与非激酶区异常导致的耐药相关，如小G蛋白Rho信号通路、Src信号通路等。因此，深入研究BCR-ABL非依赖性耐药对于开发多靶点药物和最终治愈CML具有重要意义。
　　 EphB4是受体酪氨酸激酶家族成员之一，既往研究提示:EphB4参与的细胞生物学过程主要有细胞迁移及细胞粘附，与肿瘤的发生发展及血管生成密切相关。最新研究发现，EphB4作为骨髓微环境中的crosstalk分子，可以调节骨髓造血干细胞与骨髓基质细胞的相互作用，在细胞粘附介导的耐药(CAM-DR)过程中发挥了枢纽作用。那么，EphB4是否与CML伊马替尼耐药相关呢？其作用机制如何呢？这正是本课题研究目的所在。
　　 目的:探讨EphB4在慢性髓系白血病进展及耐药中的作用机制
　　 方法:1.临床水平检测:经知情同意，收集慢性髓系白血病患者骨髓原始细胞，其中慢性期12例，进展期9例，使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心方法分离单个核细胞，TRIzol提取总RNA，反转录为cDNA，以GAPDH为内参，Q-PCR方法检测各个临床标本中EphB4的mRNA表达水平。蛋白裂解液提取总蛋白质，以β-actin为内参，Westernblot方法检测各个临床标本中EphB4的蛋白质表达水平。
　　 2.细胞水平检测:分别培养野生型K562细胞株和耐伊马替尼的K562-R细胞株，于细胞生长对数期收集细胞，TRIzol提取总RNA，反转录为cDNA，Q-PCR方法检测各个细胞株中EphB4的mRNA表达水平。蛋白裂解液提取总蛋白质，以β-actin为内参，Westernblot方法检测细胞株中EphB4的蛋白质表达水平。
　　 3.RNAi干扰EphB4的表达水平
　　 ①EphB4慢病毒干扰载体的构建:RNA干扰序列于ABI在线软件自行设计，共设计三条干扰序列和一条对照序列(shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNAcontrol)，委托上海invitrogen公司化学合成。慢病毒载体为lentilox3.7(pLL3.7)，经Hpa(I)及Xho(I)内切酶将载体线性化后分别将四条备用的序列与载体连接，次日转化感受态细胞并挑取单菌落，扩大培养后提取质粒，委托广州赢森公司测序鉴定。
　　 ②效率载体的筛选:将构建好的载体经脂质体包装后分别转染293T细胞，48小时荧光显微镜观察，提取RNA和总蛋白，分别使用Q-PCR和WB方法检测EPHB4的表达情况，选择干扰效率最高的载体进行包装。
　　 ③慢病毒包装:选择干扰效率最高的包装质粒pll3.7-EphB4-shRNA2进行质粒大提，联合两个包膜质粒p-CMV-VSV-G，p-CMV-dr8.9共转染包装细胞293T细胞，6小时换液，72小时收集上清，4000g离心5分钟，0.45um滤膜过滤，-80度保存。
　　 ④稳定干扰EphB4的K562-R细胞株的建立:使用病毒液感染K562-R细胞，96小时荧光镜下观察，使用流式细胞仪分选出带有荧光的细胞后继续扩大培养，Q-PCR及Westernblot方法检测EphB4的表达水平变化，并命名为K562-R-EphB4-shRNA。
　　 4.K562-R-EphB4-shRNA细胞的生物学特性分析:
　　 ①药物耐受性分析:CCK-8法检测K562、K562-R-EphB4-shRNA，K562-R细胞对梯度浓度伊马替尼的耐药性，通过计算细胞抑制率，得出各自IC50值，并行统计学分析。
　　 ②细胞周期及细胞凋亡分析:分别以梯度浓度伊马替尼处理K562，K562-R-EphB4-shRNA，K562-R细胞，APC-AAD试剂、PI染色结合流式细胞仪方法检测细胞凋亡率及细胞周期分析，并行统计学分析。
　　 5.EphB4对下游信号分子表达的影响
　　 ①基因芯片分析K562-R-EphB4-shRNA细胞株与K562-R细胞株的表达谱差异，并分析差异基因及所涉及的主要信号通路。
　　 ②数据挖掘方法分析CML耐药发生所参与的信号通路。将其与我们前期得到的信号通路比较，得出参与耐药较为重要的CMLIM信号通路。
　　 ③在信号通路中找出表达变化的基因，得出EphB4可能调控的分子并进行初步验证。
　　 6.统计学分析:用SPSS13.0统计软件包处理，P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　 结果:1.EphB4在12例CMLIM耐药原代细胞的表达水平高于CMLIM敏感骨髓原代细胞，二者具有显著性差异(P=0.000)。EphB4蛋白在4例CMLIM耐药原代细胞中的表达水平高于CMLIM敏感细胞(P=0.000)。
　　 2.EphB4在IM耐受的K562-R细胞的表达水平高于野生型K562细胞，二者具有显著性差异(P=0.000)。
　　 3.测序后证实目的片段均连接成功，经筛选，shRNA2为干扰效率较高的包装载体。K562-R细胞经慢病毒感染及流式细胞仪分选后测定GFP阳性率为80％，Q-PCR和WB检测EPHB4在细胞中稳定低表达，K562-R-EphB4-sh稳定低表达细胞株建立。
　　 4.CCK8法检测K562-R-EphB4-sh细胞对于伊马替尼的敏感性部分恢复，其IC50(IC500.7228±0.04752μM)较K562-R细胞(IC502.8101±0.04674μM)下降，但其敏感性仍低于野生K562细胞(IC500.1207±0.0234μM)，三组IC50值有显著性差异(P=0.000)。
　　 5.细胞周期分析发现，经相同浓度相同时间伊马替尼处理后，K562-R-EphB4-sh细胞G2/M期比例较K562-R细胞增加，但仍低于野生型K562细胞。
　　 6.细胞凋亡分析发现，经相同浓度相同时间伊马替尼处理后，K562-R-EphB4-sh细胞的凋亡率较K562-R细胞增加，但仍低于野生型K562细胞。
　　 7.综合文献复习、基因芯片及生物信息学分析，我们得出了EphB4致IM耐药的可能机制:首先，EphB4可能调控细胞内BCR-ABL下游信号分子RAS/MEK/ERK使得CML细胞增殖失控凋亡受阻，其次，EphB4可能调控细胞内非BCR-ABL下游的信号分子MLCP、VAV1等来调节细胞骨架迁移变化，再次，EphB4可能通过与细胞膜整合素分子ITGA/ITGBcrosstalk增强细胞间的相互粘附，导致细胞粘附异常，这些因素共同引发EphB4相关的CMLIM耐药。
　　 结论:EphB4在CMLIM耐药的骨髓原代细胞中的表达较敏感细胞中的升高，在K562-R细胞中的表达较K562细胞升高。EphB4敲除后，K562-R细胞对于IM的敏感性部分恢复。EphB4致IM耐药机制为BCR-ABL非依赖性，一方面可能通过持续激活BCR-ABL下游信号分子致IM耐药，另一方面，可能通过与细胞膜整合素分子ITGA/ITGBcrosstalk和调控细胞内MLCP、VAV1等分子来调节细胞骨架变化及细胞粘附的发生，这些共同的调控因素最终导致了白血病细胞IM耐药。

目录

摘要

前言

第一章 EphB4在慢性髓系白血病骨髓原代细胞及细胞株中的表达分析

1 材料

2 实验方法

3 结果分析

4 讨论

5 小结

第二章 稳定低表达EphB4的K562-R细胞株的建立

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

第三章 K562-R-EphB4-sh细胞株对伊马替尼敏感性分析

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

第四章 EphB4致CMLIM耐药的表达调控机制分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

全文小结

参考文献

附录 缩略词汇表

博士期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明