稳定低表达CD44的ABC型弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株的建立及其生物学活性研究

摘要

研究背景及目的：
　　 弥漫性大B细胞性淋巴瘤(diffuselargeB-celllymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin'slymphoma，NHL）中最常见的一种，约占成人NHL的30％～40％，为一组临床表现、形态学、免疫表型和遗传学都具有明显异质性的淋巴瘤。这种异质性还体现在对治疗反应的不一致以及预后的差异。40％～50％的DLBCL患者可通过传统的联合化疗达到持续缓解，其余的则常表现为原发耐药或缓解后复发。如何通过各种因素判断患者预后，早期干预治疗，是DLBCL治疗成功的关键。国际预后指标(internationalprognosticindex，IPI)对判断DLBCL的预后具有重大的指导意义，但它并不能反映肿瘤发生过程中的分子生物学本质。运用基因芯片技术，根据DLBCL基因表达谱(GEP)的差异，可以将DLBCL分为三型:预后较好的生发中心B细胞样亚型(GCB)，外周血活化B细胞样亚型(ABC)，以及第3型(type3)。有趣的是GCB-DLBCL和ABC-DLBCL的预后明显不同，GCB-DLBCL接受化疗的效果较好，而ABC-DLBCL化疗效果不佳。导致这种现象的原因，目前尚不明确，但基因表达谱的差异可能是DLBCL患者预后不同的原因之一，因此寻找不同蛋白在两种类型DLBCL的表达差异可能帮助我们找到不同的预后指标。
　　 CD44是一种重要的细胞膜表面粘附分子，也是透明质酸的主要受体。在淋巴系统中，其功能与淋巴细胞的归巢、激活及凋亡密切相关。CD44在B细胞激活时表达增加，然而在进入生发中心后表达下降。随着B细胞的进一步成熟，生发中心的后代细胞如记忆细胞和浆细胞会再度表达CD44和其它归巢受体，以促进B细胞的再循环和归巢。Sabine等研究发现CD44V主要表达于NON-GCB型的DLBCL患者，此类患者采用标准的CHOP化疗方案预后不良。HorstE等证实结外的DLBCL和侵袭性DLBCL都与CD44的高水平表达有关，也提示预后不佳。因此，CD44可能是提示DLBCL分型及预后的新指标。目前关于CD44在ABC-DLBCL细胞聚集、迁移、增殖和生存过程中发挥的作用及其可能的分子机制目前尚不清楚。
　　 本研究以ABC-DLBCL细胞株SUDHL2为研究对象，运用分子生物学技术构建干扰CD44表达shRNA病毒载体，通过细胞转染技术将该表达载体转入ABC-DLBCL细胞株，建立稳定低表达CD44的ABC-DLBCL细胞株，并进一步研究CD44沉默对ABC-DLBCL细胞株生物学行为的影响。
　　 材料和方法：
　　 1、分别针对3个靶点设计干扰人CD44的shRNA序列，化学合成相关序列，并与慢病毒载体连接，获得重组载体pGFP-shCD44。
　　 2、将重组载体pGFP-shCD44质粒转化至DH5α感受态细菌中，涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板，挑选阳性克隆扩大培养。从扩大培养的DH5α细菌中提取质粒，进行双酶切及测序鉴定，证实shRNA序列的正确连接。
　　 3、重组载体以脂质体法（LipofectamineTM2000）转染至包装细胞Phoenix293细胞中，48h于荧光显微镜下查看GFP表达情况。分别于48h和72h时收集病毒上清转染目的细胞SUDHL2，转染后120h后进行流式分选，将GFP+细胞进行扩大培养，荧光显微镜下观察GFP表达情况并检测GFP阳性率，提取总RNA，行RT-PCR验证CD44基因在转染重组载体pGFP-shCD44的细胞株中是否沉默。
　　 4、扩大培养成功沉默CD44的SUDHL2细胞株，通过细胞形态学、MTT、流式细胞术及Transwell等方法检测表达CD44基因对SUDHL2细胞株的增殖、细胞周期及迁移等的影响。
　　 5、统计学分析:结果采用SPSS13.0软件进行数据处理，细胞迁移率单因素均数比较若方差齐使用One-WayANOVA方差分析，LSD方法进行多重比较;若方差不齐则使用采用近似F检验（Welch方法）代替方差分析后采用DunnettT3方法进行多重比较;MTT多因素均数比较使用析因设计方差分析进行统计;计量资料用均数±标准差表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、逆转录病毒载体pGFP-shCD44直接测序证实与设计的shRNA序列相符。
　　 2、以脂质体法将重组载体pGFP-shCD44转染至包装细胞Phoenix293细胞中，转染后24h、48h、72h后于荧光显微镜下观察到大量绿色荧光。分别于48h、72h收集病毒上清。病毒上清转染目的细胞SUDHL2后72h进行流式分选，扩大培养后在荧光显微镜下可见大量GFP表达，将GFP阳性细胞扩大培养并提取总RNA，RT-PCR和流式细胞术证实CD44基因在SUDHL2细胞株中被沉默。
　　 3、CD44相关基因的RT-PCR结果显示:SUDHL2、SUDHL2+pGFP和SUDHL2+pGFP-shCD44细胞中，Bcl-6、Stat-3及Mum-1均有表达，且相互之间无明显差异。
　　 4、细胞形态学结果显示:SUDHL2细胞:细胞胞体较小，呈圆形，边缘规则，无突起，浆少量、蓝色，未见颗粒;细胞核大，染色质致密;SUDHL2+pGFP细胞:细胞胞体小，呈圆形，边缘不规则，可见瘤状突起，胞浆中等，蓝色，可见少量空泡。染色质致密;SUDHL2+pGFP-shCD44细胞株:细胞胞体大，呈圆形或椭圆形，胞浆丰富，深蓝色，空泡较多，无颗粒;核大而不规则，核质疏松。
　　 5、MTT结果显示:SUDHL2、SUDHL2+pGFP及SUDHL2+pGFP-shCD44三组细胞间增值率的差别有统计学意义（F=69.742，P＜0.001）;0h、24h、48h和72h的OD值进行析因设计的方差分析，差别有统计学意义(F=525.116，P＜0.001);时间和细胞之间有交互效应(F=11.165，P＜0.001)。其中0h时3组间的OD值无明显差异（P=0.812），24h、48h和72h时均有明显差异(P=0.013，＜0.001，＜0.001)，结合多重比较结果显示:SUDHL2+pGFP-shCD44细胞的增值率显著低于与SUDHL2、SUDHL2+pGFP细胞株(P＜0.001，＜0.001)。而SUDHL2和SUDHL2+pGFP细胞株增值率的比较差异无统计学意义(P=0.647)。
　　 6、细胞凋亡检测结果:SUDHL2+pGFP-shCD44和SUDHL2、SUDHL2+pGFP组细胞相比，凋亡细胞比例明显增高。提示CD44沉默诱导了SUDHL2细胞的凋亡。
　　 7、Transwell实验结果显示:方差齐性检验示方差齐(F=1.531，P=0.290)，三组间的迁移率比较差异具有统计学意义（F=52.672，P＜0.001）。其中SUDHL2+pGFP-shCD44细胞的迁移率和SUDHL2、SUDHL2+pGFP细胞相比差异有统计学意义(P＜0.001，＜0.001)。由此可见，CD44沉默后SUDHL2细胞的迁移率降低。
　　 结论：
　　 我们成功构建了干扰CD44表达的shRNA病毒载体，建立了稳定低表达CD44的SUDHL2细胞株。在SUDHL2细胞中CD44的表达与Bcl-6、Stat-3及Mum-1的表达无明显相关。CD44沉默能够诱导SUDHL2细胞凋亡，抑制SUDHL2细胞增殖和迁移。

目录

摘要

前言

第一部分 pGFP-shCD44载体的构建及稳定低表达CD44的ABC-DLBCL细胞株的建立

1．材料

2 方法

3．实验结果

4．讨论

第二部分 稳定低表达CD44的ABC-DLBCL细胞株的生物活性研究

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

全文小结

本文创新性

本文不足与展望

参考文献

致谢

声明

统计学证明