抑郁大鼠甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和环磷酰胺药动学及CYP450浓度和活性研究

摘要

目的:长期以来，临床药理学研究强调了影响药物治疗的生物学因素，而忽略了影响药物治疗的社会心理因素。在临床实践上我们注意到，心境障碍影响着重大疾病患者药物治疗的全程和效果，但其生物学作用机制不明。据此，本课题旨在通过建立慢性不可预见性应激抑郁大鼠模型，考察临床常见的抗肿瘤药物甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）以及环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）在抑郁模型大鼠与正常大鼠体内药动学差异，并比较抑郁模型大鼠与正常大鼠肝组织药物代谢酶CYP450总酶浓度/活性差异，研究心境障碍对MTX、5-FU和CP在大鼠体内的药动学是否有影响，探讨抑郁心境障碍引起的药物代谢和药效与正常心境状态下的差异的机制，期望发现抑郁心境障碍影响药物代谢和药物疗效的一般规律及药酶基础上的分子机制，为构建创新的社会心理药理学奠定初步的理论和实践基础，为临床药理学研究提供一个新思路，最终为指导临床合理用药服务。
　　 方法:1.建立抑郁大鼠模型成年Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠54只，体质量180±20g，平均分成三批，分别为MTX组、5-FU组和CP组。实验前大鼠正常饲养一周后，每批大鼠随机平均分为抑郁模型组和正常对照组，抑郁模型组大鼠单笼饲养，正常对照组5只一笼群居饲养。抑郁模型组大鼠连续8周给予慢性不可预见性温和应激(chronicunpredictablemildstress，CUMS)，建立抑郁大鼠模型。正常对照组大鼠正常饲养。
　　 2.模型确证根据抑郁症的神经生物学基础理论，分别采用敞箱实验(Open-fieldtest)和酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)测定抑郁模型组和正常对照组大鼠在造模前后的行为学和血浆中5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)浓度，确证模型建立的成功性。
　　 3.收集血样及血药浓度测定抑郁模型建立成功后，抑郁组和对照组大鼠分别按体重尾静脉注射给予MTX（2mg·kg-1）、5-FU(30mg·kg-1)以及CP（10mg·kg-1），在给药后不同的时间点眼内侧静脉丛采血，离心，收集血浆样品，-20℃保存待测。MTX、5-FU和CP采血时间点分别为0.083、0.5、1、2、4、8、12h;0.05、0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6h和0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12h。
　　 4.血药浓度测定分别采用荧光偏振免疫法(FPIA)、高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS/MS)测定血浆中MTX、5-FU和CP的浓度。采用DAS(DrugandStatistics)2.1版本药动学软件，按二室模型进行血药浓度数据分析，计算相关药动学参数。
　　 HPLC法测定5-FU血浆浓度的色谱条件:色谱柱HypersilODS-C18（4.0×250mm，5μm）;流动相（0.01M醋酸水溶液∶乙腈=99:1，V∶V）;流速(1ml·min-1);紫外检测波长270nm;柱温(25℃)。
　　 HPLC-MS/MS法测定CP血浆浓度的色谱条件:色谱柱AgilentZORBAXSB-C18(2.1mm×150mm，5μm);流动相(甲醇:0.1mol·1-1甲酸铵缓冲液=95∶5，V∶V);流速(0.4ml·min-1);柱温(40℃)。质谱条件:电喷雾电离源(ESI)，正离子化，毛细管电压4000V，喷雾气压力45PSI，干燥气体流速10L·min-1，干燥气体温度350℃，扫描方式为选择性离子监测，CPm/z260.9→139.9，碰撞能量20单位，裂解电压115V，四级杆捕捉时间0.2s，异环磷酰胺(IFO)m/z260.9→153.8，碰撞能量21单位，裂解电压115V，四级杆捕捉时间0.2s，电子倍增器300V，进样量为1μl。
　　 5.肝微粒体制备在完成MTX、5-FU和CP药动学后，取抑郁组和对照组大鼠各9只，断头处死，迅速打开腹腔，取出肝脏，用4℃的0.9％的生理盐水洗净表面血污，称取1g左右的肝脏，剪碎。加入0.05mol.1-1Tris-0.25mol.1-1蔗糖(pH7.5)缓冲溶液于冰浴下将其制成匀浆液，4℃下先后以转速为10000×g和105000×g离心制备肝微粒体，将其重混悬于1ml上述缓冲溶液中，-80℃保存备用。采用BCA法测定肝微粒体中总蛋白的浓度。
　　 细胞色素P450酶系浓度和活性测定采用一氧化碳示差光谱法测定P450酶系的浓度。采用上海杰美(Gen-Med)生物技术公司荧光定量检测试剂法，以乙氧基香豆素（7-ethoxycoumarin）为底物测定乙氧基香豆素脱乙基酶(7-ethoxycoumarin-O-deacthylase，ECOD)活性，代表P450酶系的活性。
　　 6.数据处理采用SPSS16.0统计学软件和excel2007对实验数据进行统计学分析，所有结果均以(x)±s表示，P＜0.05为差异均有统计学意义。
　　 结果:1.模型建立抑郁组大鼠在造模前后行为学的水平运动得分分别为81.81±10.57和15.00±5.44，垂直运动得分分别为14.63±3.90和4.81±2.06，造模前后血浆中5-HT浓度分别为6.07±1.55和2.13±0.66ng·ml-1:对照组大鼠在造模前后行为学的水平运动得分分别为78.07±11.54和72.67±13.74，垂直运动得分分别为16.19±5.05和14.19±5.03，造模前后血浆中5-HT浓度分别为6.24±1.87和6.00±1.72ng·ml-1。造模前后两组数据相减后采用两独立样本t检验统计分析，与对照组相比，抑郁组大鼠行为学和血浆中5-HT浓度在造模后均存在显著性差异（均有P=0.000＜0.05;n=27），证明造模成功。
　　 2.血药浓度测定FPIA法测定MTX血浆浓度的检测试剂盒指控稳定，标准品浓度准确，HPLC法和HPLC-MS/MS法测定5-FU和CP血浆浓度方法学精密度、准确度以及稳定性良好(RSD％＜3)。所得MTX、5-FU和CP血浆浓度数据真实可靠。
　　 3.血药浓度-时间曲线和药动学抑郁组和对照组大鼠血浆MTX浓度基本一致，血药浓度-时间曲线也几乎相同，采用两独立样本t检验统计分析两组大鼠的MTX药动学参数，均无显著性差异(P＞0.05，n=9);两组大鼠血浆5-FU和CP浓度均存在差异，抑郁组大鼠各个时间点的5-FU和CP浓度几乎均显著低于正常组，采用两独立样本t检验统计分析两组大鼠的5-FU和CP药动学参数，Cmax、t1/2β、AUC(0-∞、MRT(0-∞)、CL值均存在显著性差异(P＜0.05;n=9)。
　　 4.细胞色素P450酶系浓度和活性抑郁组大鼠肝微粒体中细胞色素P450酶系总浓度和总活性均显著高于对照组，对两组大鼠肝微粒体中细胞色素P450酶系总浓度和总活性数据进行两独立样本t检验统计分析，均存在显著性差异(P＜0.05，n=9)。
　　 结论:抑郁心境障碍改变5-FU和CP在SD大鼠体内的药动学，增加肝微粒中细胞色素P450酶系总浓度，增强其总活性。但对MTX的药物动力学没有影响。

目录

摘要

前言

第一章 抑郁大鼠模型的建立

材料及设备

方法

结果

讨论

第二章 MTX、5-FU和CP在抑郁大鼠体内药动学

第一节 大鼠血浆中MTX浓度测定及药动学

材料与设备

方法

结果

讨论

第二节 大鼠血浆中5-FU浓度测定及药动学

材料与设备

方法

结果

讨论

第三节 大鼠血浆中CP浓度测定及药动学

材料与设备

方法

结果

讨论

第三章 CYP450酶系浓度和活性测定

材料与设备

方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述

中英文对照缩略词表

攻读硕士期间发表的论文

致谢

声明

统计学审稿证明