肾移植受者CYP3A4、CYP3A5、ABCB1、ABCC2和HLA-B*1502基因多态性与移植术后肝脏损害的相关性研究

摘要

背景：
　　 器官移植术后肝损伤发病率高达20％～50％，且与药物暴露水平密切相关。环孢素(cycloporine，CsA)属于钙调神经酶抑制剂，通过减少急性排斥反应率和早期免疫损伤发生，对肾移植成功整体上有革命性的影响。然而，CsA具有治疗指数窄、药动学和药效学个体差异大的特点。此外，移植术后肝损伤是临床上免疫抑制剂减量甚至撤药一个主要原因。因此，在器官移植领域，个体化免疫抑制治疗仍然面临巨大挑战。治疗药物监测(TDM)对降低急性排斥反应率和毒性反应有一定作用，但它仍有一定的局限性:首先，TDM的起始剂量仅根据体重计算，因此需要增加其他衡量指标;其次，通常需要数天至数周才能达到足够的药物暴露量，因此只能在用药后开展TDM监测，不能事先确定个体化治疗的最佳剂量;第三，免疫抑制剂的体内过程复杂，受多种因素影响。对于这些限制，有必要寻找其他的方法来达到个体化免疫抑制治疗。最近，一些关于免疫抑制剂基因组学研究可能对未来合理用药有重要意义。
　　 药理学和药物基因组学研究表明，遗传因素影响药物代谢和分布过程，可能对初始剂量预测和不良反应风险评估有重要意义。据估计，20％～95％的药物处置及效应差异与遗传因素有关。已证明细胞色素P450(CYP)同工酶的基因多态性对CsA药动学影响显著，CYP3A5*3突变导致CYP3A5酶失活，已被证明与酶活性减少和毒性发生风险增加有关。虽然多态性检测有助于在抗排斥治疗开始前识别高危患者，但基因测试还无法应用于日常临床实践，这可能与低突变率有关。近来的基因组学研究大多集中在数目有限的药物代谢酶、药物转运子或药物靶标分子编码区，固定给药剂量时，药物代谢酶或转运子的基因变异可能与个体差异产生有关。
　　 目的：
　　 本课题研究基因多态性对肾移植术后肝损害发生的影响，进而弄清肝损害的发生机理，为肾移植患者肝损害的防治和环孢素的合理应用提供理论基础。
　　 方法：
　　 采用PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)方法对339名肾移植患者进行CYP3A4*5、CYP3A4*6、CYP3A4*18B、CYP3A5*3、ABCB11236C＞T、ABCB12677G＞T/A、ABCB13435C＞T、ABCC21249G＞A单核苷酸多态性位点的基因型检测;采用Real-timePCR方法检测所有入选患者的ABCC2基因rs717620(G/A)基因多态性。HLA-B*1502多态性的检测采用PCR-SSP(PCRsequencespcificprimers)的方法。用荧光偏振免疫法检测肾移植患者的CsA血药浓度，根据肾移植患者发生肝脏损伤的情况分为CsA致肝功异常组、其他原因肝功异常组和对照组。根据肝损害诊断标准(Hy'slawcriteria)，将患者分为移植术后肝损害组、肝功能异常组和对照组。所有入选的339名中国肾移植患者均详细记录性别、移植时年龄、身高、尸肾或亲属移植、体重和BMI、移植时间、糖尿病家族史、透析时间、乙肝和丙肝感染史等一般临床资料，及移植术后7日、1、3、6、12、24、36和60个月的CsA口服日剂量与血谷浓度、泼尼松和MMF剂量、肝肾功能、空腹血糖(FPG)等检测结果。
　　 计量资料结果用均值±标准差表示，采用t检验、单因素方差分析和重复测量方差分析法比较各分组间的临床资料差异。组间基因型和等位基因分布差异采用x2检验。采用logistic回归分析移植术后肝脏损害和CsA肝毒性发病的危险因素。所有数据均采用SPSS13.0软件进行处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 339位入组的肾移植患者中，237例被诊断为CsA肝毒性组。术后3月、6月和12月FPG比较，CsA肝毒性组的FPG均显著高于对照组(P＜0.05)。术后7日两组间的CsA肝毒性组的CO明显高于对照组(P＜0.05);术后7日、一月和三月，CsA肝毒性组的CO/D明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。logistic回归显示:术后6月高CO和术后1年的高FPG是CsA肝毒性发病的危险因素
　　 339位入组的肾移植患者中，125例被诊断为发生移植术后肝损害。结果显示，术后7天、3月、6月和12月FPG比较，移植术后肝损害组患者的空腹血糖均显著高于对照组(P＜0.05);移植术后7日、1月和3月，移植术后肝损害组的CO/D均明显高于对照组(P＜0.05);术后7日移植术后肝损害组的CO高于对照组(P＜0.05)。Logistic回归分析结果显示:男性是移植术后肝损害发病的危险因素。
　　 本研究中，未发现CYP3A4*5和CYP3A4*6突变等位基因，CYP3A4*18B突变等位基因发生频率为38.89％。与对照组相比，CsA致肝功异常组CYP3A4*18B/*18B分布频率明显降低（P＜0.01），CYP3A4*1/*1分布明显增加(P＜0.05);其他原因肝功异常组的CYP3A4*1/*18B分布频率明显增加(P＜0.05);CsA致肝功异常组的CYP3A4*1/*1分布频率亦明显高于其他原因肝功异常组（P＜0.01）。肾移植术后一月和三月，携带*1/*1野生型的个体CsA谷浓度明显高于*18B/*18B突变纯合子个体(P＜0.05)。CYP3A4*18B与移植术后肝损害的发病密切相关，*18B在移植术后肝损害组的分布频率明显低于对照组(P＜0.05)。
　　 在339名肾移植患者中，CYP3A5*3突变等位基因频率为73.54％。*3等位基因在CsA肝毒性组的分布频率明显高于对照组（P＜0.01）。CYP3A5*3突变与CsA肝毒性密切相关。与对照组相比，CsA致肝功异常组的CYP3A5*3/*3分布频率明显增高（P＜0.05）。肾移植术后七天和一月，CYP3A5*3/*3组和*1/*3组的CsA血谷浓度均明显高于*1/*1组（P＜0.05）。CYP3A5*3等位基因在移植术后肝损害组和对照组间的分布无明显差异(P＞0.05)，*3突变等位基因对肾移植术后免疫抑制剂肝损害发生无明显影响。
　　 339例肾移植患者中，ABCB11236C＞T突变等位基因发生频率为64.25％。CsA致肝功异常组与对照组间T等位基因分布无明显差异(P＞0.05);1236C＞T突变与环孢素肝毒性发病无明显相关。基因型分析显示，1236C＞T多态性对CsA的CO无明显影响。1236T等位基因在移植术后肝损害组和对照组间的分布无明显差异（P＞0.05），1236T突变等位基因对肾移植术后免疫抑制剂肝损害发生无明显影响。
　　 ABCB12677G＞T/A突变等位基因发生频率为51.54％。CsA致肝功异常组与对照组间T/A等位基因分布无明显差异(P＞0.05);ABCB12677G＞T/A突变与CsA肝毒性发病无明显相关。基因型分析显示，ABCB12677G＞T/A多态性对CsA血谷浓度无明显影响。2677G＞T/A等位基因在移植术后肝损害组和对照组间的分布无明显差异（P＞0.05），2677G＞T/A突变等位基因对肾移植术后免疫抑制剂肝损害发生无明显影响。
　　 本研究中ABCB13435C＞T突变等位基因发生频率为35.75％。CsA致肝功异常组与对照组间T/A等位基因分布无明显差异(P＞0.05);ABCB13435C＞T突变与环孢素肝毒性发病无明显相关。基因型分析显示，ABCB13435C＞T多态性对CsA的CO无明显影响。3435C＞T等位基因在移植术后肝损害组和对照组间的分布无明显差异（P＞0.05），3435C＞T突变等位基因对肾移植术后免疫抑制剂肝损害发生无明显影响。
　　 ABCC2基因rs717620的突变A等位基因发生频率为19.23％。与对照组相比，CsA致肝功异常组AA分布频率明显降低(P＜0.05)，GG基因型分布明显增加(P＜0.05);CsA致肝功异常组与对照组比较，A等位基因分布频率明显降低(P＜0.05);rs717620显示与CsA相关的肝脏损害发生密切相关。基因型分析显示，rs717620位点多态性对CsA的CO无明显影响。rs717620位点多态性与移植术后肝损害的发病密切相关，A等位基因在移植术后肝损害组的分布频率明显低于对照组(P＜0.05)。
　　 ABCC21249G＞A的突变等位基因发生频率为10.72％。CsA致肝功异常组与对照组间A等位基因分布无明显差异（P＞0.05）;ABCC21249G＞A在两组间分布也无明显差异（P＞0.05）。ABCC21249G＞A突变与环孢素肝毒性发病无明显相关。基因型分析显示，ABCC21249G＞A多态性对CsA的CO和CO/D均无明显影响。ABCC21249G＞A多态性与移植术后肝损害的发病密切相关，ABCC21249A在移植术后肝损害组的分布频率明显高于对照组(P＜0.05)。
　　 本研究中HLA-B*1502突变等位基因发生频率为22.64％。CsA致肝功异常组与对照组间HLA-B*1502阳性等位基因分布无明显差异（P＞0.05）;HLA-B*1502突变与环孢素肝毒性发病无明显相关。基因型分析显示，HLA-B*1502多态性对CsA的CO和CO/D均无明显影响。HLA-B*1502等位基因在移植术后肝损害组和对照组间的分布无明显差异(24.0％vs20.0％，P＞0.05)，HLA-B*1502突变等位基因对肾移植术后肝损害发生无明显影响。
　　 结论：
　　 CYP3A4*18B和CYP3A5*3基因多态性对CsA谷浓度有明显影响，ABCB11236C＞T、ABCB12677G＞T/A、ABCB13435C＞T、ABCC21249G＞A和HLA-B*1502多态性对CsA的处置无明显影响，也与CsA肝毒性和移植术后肝损害发病无明显相关性。男性、术后六月高CsA血浓度、术后一年高FPG、CYP3A5*3和rs717620位点G等位基因是CsA肝毒性发病的危险因素，CYP3A4*18B等位基因是保护性因素。男性、ABCC21249A等位基因和rs717620位点G等位基因是移植术后肝损害发病的危险因素，CYP3A4*18B等位基因是保护性因素。

目录

摘要

前言

第一章 肾移植术后肝脏损害发病的危险因素研究

1．研究对象

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第二章 CYP3A基因多态性与肾移植术后肝损害的相关性研究

1．对象与材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第三章 ABCB1基因多态性与肾移植术后肝损害的相关性研究

1．对象与材料

2．实验方法

3．结果

4．讨论

第四章 ABCC2、HLA-B*1502基因多态性与移植术后肝损害的相关性研究

1．对象与材料

2．实验方法

3．结果

4．讨论

全文总结

参考文献

综述

攻读学位期间发表论文

中英文缩略词表

致谢

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