兔真皮内注射自体真皮填充物后真皮结构改变的对比研究

摘要

青春期之后，或是中年之后，人体表面的组织、结构发生老化、松弛及萎缩等改变，从而引起皱纹产生。在皮肤的老化过程中真皮细胞也渐呈扁平，真皮纤维母细胞合成胶原纤维的能力下降，胶原含量逐渐下降。真皮内弹力纤维变性，失去弹性，真皮乳突层的弹力纤维网减少甚至消失。真皮胶原纤维合成减少和弹性纤维变性，是皮肤老化引起皱纹、松弛及下垂的主要原因。
　　 近年来，随着整形美容外科的蓬勃发展，以及人们对美的标准及意识的提升，而注射美容具有其不可取代的优点，如创伤小、效果显著、恢复快等，使得注射性填充材料在面部注射除皱方面的应用及需求量大大增加。
　　 自1982年FDA批准牛胶原蛋白可应用于注射美容以来，真皮填充物的应用越来越普遍，其种类也有所增加，总体可归为三大类:生物来源的填充物，人工合成的填充物及有活力的细胞移植物(1)。其中应用较多的包括牛和人的胶原蛋白，透明质酸，PMMA等。尽管上述这些填充物能够快速达到显著的改善效果，但它们均有各自的缺点，譬如，维持时间有限、发生病毒感染、引发免疫反应等(2-4)。从更深的层面来讲，它们仅仅是填充剂，只能暂时从外观上达到改善的目的，并不能刺激皮肤合成胶原蛋白(5)，而胶原蛋白的流失正是皮肤松弛、衰老的根本原因(6)，即这些填充物并不能从根本上解决面部老化的问题，无法维持长期疗效。
　　 众所周知，真皮中的胶原蛋白由成纤维细胞合成并分泌，它是皮肤组织细胞外基质的主要成分。随着年龄的增长，皮肤中成纤维细胞的数量逐渐减少，胶原蛋白的总含量以每年1％的速度流失(7、8)，致使皮肤变薄、丧失弹性，最终形成皱纹。因此，增加真皮内成纤维细胞的数量，刺激成纤维细胞分泌胶原蛋白才能从根本上解决面部老化的问题。
　　 近年来，有活力的细胞移植物逐渐成为面部年轻化的关注焦点。自体细胞移植物在面部年轻化中的应用，不仅避免了其他填充物的各种副作用，而且存活的细胞似乎能发挥其相应作用，从根本上改善老化的皮肤。目前已知有望达到长久除皱效果的自体细胞有两种:人自体真皮成纤维细胞(Dermal Fibroblast，DF)和脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)。
　　 自1995年，体外培养的成纤维细胞(Isolagen)就已被当做一种有活性的，动态的蛋白修复系统用来改善皮肤老化及皮下组织缺损(9)。Isolagen疗法是取患者自体皮肤，体外培养真皮成纤维细胞，待达到一定细胞数量级(1×107个)后，配制成细胞悬液，即自体细胞移植物，注射填充面颈部皱纹，鼻唇沟或小面积凹陷性疤痕。此后各国学者对细胞的存活，注射后副作用，效果维持时间作了各项相关性研究，并取得一定进展。各项临床研究及动物实验证明，自体成纤维注射可达到理想的除皱效果，且维持时间相对持久(9-14)，而受区未产生炎症反应或免疫排斥，研究表明亦无成瘤风险性(10)。这可能是自体成纤维细胞存活后，能够产生大量正常的胶原蛋白，减慢自体皮肤胶原蛋白的流失速度，以达到除皱的效果。
　　 脂肪组织来源丰富，提取方便，实用性强，是近年来较受关注的自体细胞移植物的组织来源(15)。皮下脂肪组织中的基质血管片段内所含有的间充质干细胞，即脂肪组织来源干细胞(ASCs)，具有多向分化潜能（16-18），且ADSC能分泌多种细胞因子。各项临床研究及动物实验表明，自体ADSC可促进骨创伤或缺损的修复(19-21)，促进皮肤软组织创伤的愈合(22-25)，在面部年轻化方面，有研究表明，ASCs及其培养基(ASCs-CM)有抗皱、美白皮肤、抗氧化的作用(26-29)。另外还有研究表明，自体脂肪移植后受区的肤质较前明显有所改善(30)。尽管ASCs仍未像Isolagen那样被直接当作真皮填充物应用于临床除皱，但其有望应用于面部皮肤年轻化的治疗(26)。
　　 近年来，富含血小板的血浆(PRP)因其浓缩了患者自体的生长因子，也成为自体真皮填充物的一员。PRP是提取患者全血，抗凝后通过两步离心法，最终提取出全血中大部分的血小板。皮内注射PRP后，血小板被激活并释放出大量的生长因子，刺激真皮内成纤维细胞的增殖及胶原蛋白的分泌来达到除皱的效果。目前PRP已经被用来面部除皱或填充鼻唇沟。
　　 作为自体真皮填充物，DF，ASCs，PRP在面部微创美容中的应用越来越为广泛，究竟上述哪种自体填充物注射后对真皮结构的影响最大，填充效果最好，本实验以兔为模型对其进行了初步对比研究。
　　 材料与方法：
　　 1、实验试剂及器材
　　 DMEM/F12(1:1)、FBS、PBS液、胰蛋白酶均购自Hyclone公司;伊红、美蓝染液，天狼星红-苦味酸染液，油红O染液，茜素红染液，阿尔辛蓝染液，DiI染液，二甲基亚砜溶液，Ⅰ型胶原蛋白酶购自Sigma公司;兔Ⅰ型胶原蛋白抗体购自Abcam公司;柠檬酸钠溶液购自上海佳和生物科技有限公司;离心管、培养皿、吸管、过滤器等均购自Coming公司;盖玻片，载玻片，组织剪，组织镊，注射器，滤网，荧光显微镜，偏振光显微镜离心机，Sysmexkx-21血细胞计数仪等。
　　 2、成纤维细胞，脂肪组织来源干细胞的分离及培养
　　 本实验中的8只新西兰大白兔均来自南方医科大学实验动物中心。兔麻醉后取其腹股沟处皮肤及脂肪组织，分离并培养自体真皮成纤维细胞，ASCs，待细胞量达到1×107个时配制成细胞悬液行兔自体皮内注射。
　　 3、PRP的提取
　　 从兔耳缘静脉抽取全血约5ml，用浓度为3.8％的柠檬酸钠0.5ml抗凝，400×g离心力离心10min，全血即分为3层:最上层为PPP，中间层为“buffycoat”，下层为红细胞。将PPP及buffy-coat层用吸管小心吸出，移入另一离心管，将吸出的PPP及buffy-coat混合物800×g离心力再次离心10min，可见血小板沉积于底层，将上层多余的PPP丢弃，剩余的血清和血小板混合均匀即为PRP，约0.5ml。
　　 4、细胞的标记和鉴定
　　 本实验制备了兔真皮成纤维细胞(DermalFibroblast，DF)的细胞爬片，用免疫酶标染色技术鉴别从真皮成纤维细胞并检测爬片上细胞内Ⅰ型胶原蛋白的合成。用油红O对ASCs行成脂染色，用茜素红行成骨染色，用阿尔辛蓝行成软骨染色。用DiI染液分别标记体外培养的成纤维细胞和ASCs。
　　 5、动物实验
　　 将体外培养的细胞分别配制成浓度为1×107个/ml的细胞悬液，与等体积的PRP分别吸入1ml注射器备用。0.5ml的PBS为对照组。将其中六只新西兰大白兔背部剃毛，每只兔每种细胞均注射2个点，每个点注射0.1ml;同样，PRP及PBS如上述每只兔注射2个点，每点注射0.1ml。注射层次为真皮深层，可见有明显的皮肤隆起，注射点用甲紫作标记。两周时，每点均重复注射一次。
　　 另外两只兔背部均注射DiI标记后的DF和ASCs，细胞浓度与注射量与上述实验组均相同，两周时，每点均重复注射一次。
　　 6、组织学检测
　　 各个注射点均于四周后取材，将样本分为四组:DF组（成纤维细胞注射组）、ASCs组（脂肪组织来源干细胞注射组）、PRP组（富含血小板血浆注射组）、PBS组（PBS注射组）。每个组织块切片均行伊红-美蓝、天狼星红-苦味酸、免疫组织化学染色。观察并比较皮肤样本的厚度、各样本皮肤中Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的比例、胶原蛋白的表达量。同时取各组皮肤样本提取Ⅰ型胶原蛋白，使用蛋白印迹法(westernblot)来检测各组样本中Ⅰ型胶原蛋白的表达有无差异。DiI标记的细胞注射点四周后取材，组织块行快速冰冻切片，然后荧光显微镜下观察有无荧光反应，间接反应细胞的存活情况。
　　 7、统计学分析
　　 所有数据均使用SPSS13.0进行统计学分析，兔真皮厚度检测结果及天狼星红染色分析结果均使用ONEWAY-ANNOVA进行统计学分析，P＜0.05为有显著统计学差异。
　　 结果：
　　 1、体外培养的P3代兔真皮成纤维细胞仍能合成Ⅰ型胶原蛋白，体外培养的ASCs有向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化的能力，可用于注射。
　　 2、将DiI标记的成纤维细胞及ASCs分别注射到两只兔子的背部真皮内，四周后取材，荧光显微镜下可见组织中仍有大片散在的红色荧光，证明细胞注射到真皮层中可以存活。
　　 3、可见各组皮肤组织的胶原纤维排列与对照组相比稍显紊乱。镜下观察发现DF组真皮层中蓝染的梭型细胞核数量明显多于其他各组。DF组的皮肤厚度最大，ASCs组次之，P＜0.05，PRP及PBS组皮肤厚度无显著统计学差异，P＞0.05。
　　 4、各组皮肤组织中的Ⅰ型胶原蛋白含量并无显著统计学差异，P＞0.05，但DF组和ASCs组真皮中的Ⅲ型胶原蛋白含量较其他两组高，P＜0.05，DF组和ASCs组间无显著差异，P＞0.05，PRP组和PBS组间无显著差异，P＞0.05.WesternBlot检测结果示，PBS组Ⅰ型胶原蛋白的表达量稍高，其他各组未见明显差别。
　　 结论：
　　 由注射自体真皮成纤维细胞后，真皮中的细胞数量最多，真皮最厚，与对照组相比Ⅰ型胶原蛋白含量并无显著差异，P＞0.05，但Ⅲ型胶原蛋白含量高于对照组，P＜0.05。

目录

摘要

前言

第一章 兔真皮内注射自体真皮填充物后真皮结构改变的对比研究

引言

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第二章 两种方法提取的人血清对体外培养人真皮成纤维细胞促增殖作用的比较研究

引言

1．材料与方法

2 结果

3．讨论

4．结论

综述

参考文献

附录

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