单味中药脱色及复方含药血清对体外培养人A375黑素瘤细胞黑素代谢影响的研究

摘要

研究背景与目的：
　　 皮肤色素代谢障碍与多种体内因素和环境因素密切相关，色素障碍性疾病（如白癜风、黄褐斑）易诊而难治。随着分子生物学技术的广泛应用，有关色素代谢的研究迅猛开展。国内外学者积极探索色素代谢的机制及影响因素，阐述中药调节色素代谢的作用机制，为治疗色素代谢性疾病寻找安全、有效的中药成分或方剂，对有关中药与色素的代谢方面进行了广泛的研究，但目前对其作用机理与规律仍未能得到深入的科学阐述，因此临床上缺乏较为理想治疗手段及方法。目前许多中药对酪氨酸酶活性、黑素细胞代谢的影响已经有了初步的揭示，研究的方法技术亦日益成熟。但是，大多数研究都局限于观察单味中药或复方中药的研究上，鲜有从中药色象理论的角度设计较为系统的多层次的研究，有关色象中药对黑素代谢影响与干预机理的研究尚为缺乏。吾师杨柳教授通过长期的临床探索与理论研究，在取象比类思维启示下创立了治疗色素性皮肤病的中药色象理论，形成了具有鲜明特色的理论和治疗方法。认为中药颜色与色素性皮肤病的疗效有一定的相关性，并首次将这种表明药材颜色与疗效相关的现象称之为“中药色象”，将这种治疗色素病色效相关的中药，称之为“色象中药”。初步研究中药药材颜色与色素性皮肤病的疗效之间的关系，并取得了一定的成果。我们的初步研究结果和以往学者的研究表明对药材本身的颜色与药效存在一定的关系，因此对中药色象理论的进一步研究，尤其是应用现代科学研究方法技术，对色象中药调节与干预色素代谢机理的现代分子学研究是非常有必要的。
　　 另外，白癜风作为色素脱失性疾病的典型病种，临床上易诊而难治。中医药治疗白癜风具有鲜明的特色，强调证候分型与辨证论治。但目前白癜风的证候分型及方药种类繁多，缺乏统一性和标准化。此外，在临床实践中许多白癜风患者出现“无症可辨”或“少症如何辨”的情况，基本除了皮肤出现白斑以外，没有其他特殊的伴随症状。对此，吾师提出了以“祛风、活血、补肾”为基本治则，并结合分期论治的治疗方案。
　　 基于此，本研究通过查阅大量的文献资料及临床资料，并结合临床实践经验，在以往研究的基础上，筛选出中医传统治验及现代研究表明治疗色素病有效的使用频率高的黑白两类中药共10味，以目前研究技术较为成熟的酪氨酸酶、细胞增殖及黑素合成作为观察指标，研究单味中药经活性炭脱色后对体外培养的人A375黑素瘤细胞黑素代谢的影响，以及采用中药血清学的方法研究4种具有不同功效的复方含药血清对黑素代谢的影响，进一步探讨色象中药与色素代谢的相关性，为色象理论及临床辨证用药提供科学依据，为以后白癜风的辨证治疗提供实验依据，同时为中医药治疗色素病的研究提供新的思路，以有效地指导临床。
　　 方法与内容：
　　 1、通过查阅大量的文献资料及临床资料，并结合临床实践经验，在以往的研究基础上，筛选出中医传统治验及现代研究表明治疗色素病有效的使用频率高的中药，依据饮片的外在颜色分为黑（深色）、白（浅色）两组，每组各选5味药作为代表药，制备各单味中药水提液，取上述中药水提取液100ml，用紫光分光光度法进行测定吸光度值，采用正交试验法对每味中药的脱色工艺进行筛选，以最佳脱色条件进行脱色后取上清液过滤后备用，并用不含胎牛血清的培养基进行稀释，使药物终质量浓度为10μg/ml。
　　 2、参照医学实验动物学及中药血清学的方法，制备四种不同功效配伍的复方含药血清，并用不含胎牛血清的培养基进行稀释，使含药血清的终浓度为5％、10％、20％、30％，并以此四种浓度进行研究。
　　 3、应用细胞培养学技术，将人A375黑素瘤细胞株进行体外培养。采用多巴速率氧化法测定黑白两组中药水提取液脱色前后、四种不同功效配伍的复方含药血清在不同浓度对细胞中酪氨酸酶活性的影响，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定黑白两组中药水提取液脱色前后、四种不同功效配伍的复方含药血清在不同浓度对细胞增殖的影响;采用NaOH裂解法测定黑白两组中药水提取液脱色前后、四种不同功效配伍的复方含药血清在不同浓度对细胞中黑素合成含量的影响。每种药物每个浓度设3个复孔，重复3次，并设对照组:单纯培养基组、中药对照组（培养基+中药）和空白对照组（培养基+细胞）。
　　 3、应用SPSS13.0统计软件，分别采用单因素方差分析的Dunnett检验和析因设计资料的方差分析对单味中药和复方含药血清各组实验数据进行统计学处理与分析，数据均以（x）±s表示，以P≤0.05时表示差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、单味中药调节黑素代谢测定结果:
　　 ①未经活性炭脱色的中药中，制首乌、补骨脂、丹参、鸡血藤、墨旱莲、桃仁对TYR活性具有激活作用（P≤0.05或P≤0.01）;茯苓、白芷、白芨对TYR活性具有抑制作用（P≤0.05或P≤0.01）。而经活性炭脱色后，制首乌、墨旱莲对TYR活性无激活作用(P＞0.05)，丹参、鸡血藤、补骨脂对TYR活性的激活作用明显降低，与未脱色组比较，差异具有显著性（P≤0.05或P≤0.01）。桃仁、茯苓、白芷、白芨、白术脱色前后比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
　　 ②与空白对照组比较，未经活性炭脱色的中药中，制首乌、补骨脂、丹参、鸡血藤、桃仁对黑素细胞增殖具有促进作用(P≤0.05或P≤0.01);白芷、白芨、白术对黑素细胞增殖具有抑制作用(P≤0.01)。而经活性炭脱色后，丹参、鸡血藤对黑素细胞增殖无促进作用（P＞0.05），白术、白芨、补骨脂对黑素细胞抑制或促进作用明显降低，与未脱色组比较，差异具有显著性(P≤0.05)，茯苓脱色后对黑素细胞增殖具有促进作用，与未脱色组比较，差异具有显著性(P≤0.01)，桃仁、白芷、墨旱莲、白术脱色前后比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
　　 ③未经活性炭脱色的中药中，补骨脂、丹参、鸡血藤、桃仁对黑素细胞合成具有促进作用(P≤0.01);白芨、白术对黑素细胞合成具有抑制作用(P≤0.05)。而经活性炭脱色后，桃仁、鸡血藤对黑素细胞合成无促进作用(P＞0.05)，丹参、补骨脂对黑素细胞合成作用明显降低，与未脱色组比较，差异具有显著性（P≤0.05或P≤0.01），墨旱莲、茯苓脱色后对黑素细胞合成具有促进作用，与未脱色组比较，差异无统计学意义或具有显著性（P≤0.01），白芷脱色后对黑素细胞合成具有抑制作用，与未脱色组比较，差异具有显著性(P≤0.01)，制首乌、白芨、白术脱色前后比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
　　 2、复方含药血清对黑素瘤细胞黑素代谢测定结果:
　　 ①相应浓度各方之间比较，含药血清浓度为5％时，与空白血清对照组比较，Ⅰ方、Ⅱ方、Ⅲ方对酪氨酸酶活性激活作用不显著，仅Ⅵ方含药血清对酪氨酸酶活性有显著激活作用(P=0.014＜0.05)，Ⅵ方对酪氨酸酶的激活作用显著高于Ⅰ方、Ⅱ方（P=0.01和P=0.004≤0.01），与Ⅲ方作用无显著差异(P=0.233＞0.05);含药血清浓度为10％时，各组之间比较差异无统计学意义(P=0.124＞0.05)。含药血清浓度为高浓度(20％-30％)时，与相应浓度空白血清对照组比较，Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ方对A375细胞酪氨酸酶活性均有激活作用，以Ⅵ方作用最显著(P＜0.001)，且与相应浓度的其它三方相比，差异有统计学意义（P≤0.001）。
　　 相应复方各浓度间比较:Ⅰ方各浓度间比较，随着浓度的增加，中药对酪氨酸酶的激活作用增强，20％与30％含药血清浓度对酪氨酸酶活性的影响无显著差异(P=0.203＞0.05)，与5％和10％含药血清浓度激活作用比较，有显著差异(P＜0.01)。Ⅱ方各浓度间比较，5％、20％、30％含药血清浓度对酪氨酸酶的激活作用与10％含药血清浓度相比，均有显著差异（P≤0.05或P≤0.01）,三种浓度间无显著差异(P=0.484＞0.05)。Ⅲ、Ⅵ方各浓度间比较差异均有显著意义（P≤0.01），中药对酪氨酸酶的激活作用随着含药血清浓度的增加而增强。
　　 ②相应浓度各复方之间比较，含药血清浓度为低浓度5％～10％时，与空白血清对照组比较，各方对黑素增殖作用不显著，差异无统计学意义(P＞0.05)。含药血清浓度为20％时，与空白血清对照组比较，复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ方对黑素增殖均有明显促进作用，以Ⅵ方作用最显著(P＜0.001)，且与同血清浓度的其它三方相比，差异均有显著统计学意义(P≤0.001);含药血清浓度为30％时，与空白血清对照组比较，Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ方对A375黑素瘤细胞黑素增殖有显著促进作用（P≤0.05或P≤0.01），各方之间比较，Ⅰ方、Ⅲ方与Ⅵ方比较，差异无统计学意义(P=0.419＞0.05)，Ⅱ方与Ⅵ方相比，差异有统计学意义(P=0.001＜0.01)。
　　 相应复方各浓度间比较:Ⅰ方各浓度间比较，随着浓度的增加，中药对黑素增殖的促进作用增强，20％与30％含药血清浓度对黑素增殖的促进作用无显著差异(P=0.831＞0.05)，与5％和10％含药血清浓度促增殖作用比较，均有显著差异(P≤0.01)。Ⅱ方各浓度间比较，10％、20％、30％含药血清浓度对黑素增殖的促进作用均高于5％含药血清浓度(P≤0.01)，其中20％含药血清浓度促进作用最强，与其它浓度比较差异有统计学意义（P≤0.01）。Ⅲ方、Ⅵ方各浓度间比较，均以20％含药血清浓度促黑素增殖作用最强，与其它含药血清浓度比较，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。
　　 ③中药各复方之间促进黑素合成作用比较差异有显著统计学意义(P＜0.001)，中药含药血清均能在一定程度上促进黑素合成，各复方对黑素合成促进作用高于空白血清对照组。复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ方之间比较，三者对黑素合成促进作用无显著差异(P=0.480＞0.05)，Ⅵ方对黑素合成促进作用显著高于其它组。
　　 复方中药不同含药血清浓度对黑素合成促进作用比较差异有显著差异(P＜0.001)，随着含药血清浓度的增加，各方对黑素合成促进作用增强，10％含药血清浓度对黑素合成的促进作用显著高于5％含药血清浓度，20％与30％含药血清浓度对黑素合成的促进作用显著高于5％、10％含药血清浓度，此两种浓度间比较无显著差异(P=0.915＞0.05)。
　　 结论：
　　 1、经活性炭脱色后，黑色（深色）、白色（浅色）中药大部分失去或降低了对黑素代谢的促进或抑制作用，其中黑色药物更显著。说明药材颜色与色素代谢调节存在一定的相关性。
　　 2、具有祛风、活血和补肾三重作用的Ⅵ方在促进黑素代谢的作用上优于祛风除湿Ⅰ方、养血活血Ⅱ方和滋补肝肾Ⅲ方，含药血清浓度为高浓度时作用最显著。表明白癜风治疗以祛风、活血、补肾为基本治则效果最好，这为以后临床中白癜风以“祛风、活血、补肾”为基本治则，并结合分期论治的治疗方案提供了实验根据，对白癜风辨证论治及病因病机理论的发展都具有重要的指导意义。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学分析

第三章 结果与分析

1 单味中药脱色对黑素瘤细胞黑素代谢的影响

2 复方含药血清对黑素瘤细胞黑素代谢的影响

第四章 讨论

1 中药色象理论形成的理论基础

2 中药脱色及色素代谢调节的实验研究

3 白癜风分期论治方案及含药血清的实验研究

4 研究存在问题及展望

全文小结

参考文献

中英文对照缩略词表

研究生期间的工作成绩

致谢

声明

统计学审稿证明