沉默信息调节因子1在脂多糖激活小胶质细胞介导多巴胺能神经元毒性损伤中的保护作用

摘要

帕金森病(Parkinson's disease，PD)，一种常见的神经系统变性退行性疾病，目前关于其发病机制研究仍不明确，比较复杂，可能跟遗传因素（致病基因Parkin等的发现）、年龄老化、环境因素（如除草剂、杀虫剂的应用、接触锰金属等），体内线粒体功能紊乱与氧化应激、谷氨酸的兴奋性中毒、免疫与炎症反应异常、细胞凋亡或泛素蛋白酶体系统的功能受损等因素有关。既往炎症/免疫异常与帕金森病关系的相关研究不多，但最近从流行病调查，对PD患者死后的大脑解剖及帕金森病动物模型的研究发现，越来越有力地表明炎症在帕金森病发病机制中的重要地位。中枢神经系统的小胶质细胞如专职的巨噬细胞，保护着中枢神经系统免受外界感染和损伤，它很容易对免疫原刺激或组织损伤产生应激反应，并显著上调许多细胞因子水平，其中一小部分是营养因子，而大部分是许多炎症因子如肿瘤坏死因子-a(TNF-a)，大量的白介素，如白介素-1(IL-1)和大量自由基如一氧化氮、过氧化物及脂肪酸代谢产物等。普遍认为，小胶质细胞在炎症刺激下被激活，释放的损伤性炎症因子和氧化应激毒性产物如氧自由基等介导了颅内神经元的损伤。
　　 沉默信息调节因子(Sirtuins)是一组尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I，NAD+)依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，最初在酵母中发现、鉴定并命名为沉默信息调节因子2(Sir2)，目前认为其在许多生物进程中起重要的调节作用，如基因修复、寿命延长、代谢以及氧化应激的调节等。迄今为止，在人类已经发现有7个Sir2的同源物蛋白，分别命名为S(l)RT(1)～SIRT7，其中，SIRT1与Sir2同源性最高，也是研究最深入的。SIRT1，该蛋白广泛存在于机体成熟组织中，定位于细胞核内，它具有一个由250个氨基酸残基组成的保守的脱乙酰酶结构域，其脱乙酰化酶活性的必需基团位于第363位赖氨酸上。而且，SIRT1脱乙酰酶活性的发挥跟细胞内的氧化还原反应及新陈代谢相关，并依赖于胞质中[NAD+]/[NADH]的比率，当[NAD+]/[NADH]的比率上升时，SIRT1脱乙酰化酶活性也增强，反之则降低。白藜芦醇(resveratrol，Res，红葡萄酒中富含的一种成分)、漆树黄酮等小分子植物化合物，是其活化剂。SIRT1的抑制剂包括尼克酰胺、sirtinol等。在细胞培养研究中，SIRT1的非组蛋白细胞底物有肿瘤抑制基因p53，核转录因子NF-(□)B、叉头转录蛋白FOXO家族、核受体过氧化酶体增殖体激活受体-r(PPAR-r)和其共激活物过氧化酶体增殖体激活受体-a(PGC-a)、Ku70与肝脏的X受体(LXR)等，以上底物都跟调控细胞寿命相关基因关系密切。SIRT1能去乙酰化NF-κB、FOXO家族、p53等，进而抑制错误蛋白积聚、保护线粒体功能、干预炎症反应、降低细胞凋亡等方式起神经保护作用，在机体自身延缓神经变性退行性疾病进展中扮演着十分重要角色。
　　 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，被广泛认为是刺激大脑产生炎症的炎症源。它能通过激活核转录因子NF-κB，激活蛋白-1(AP-1)，和干扰素调节因子-3(IRF3)等一系列细胞信号转导途径，直接刺激脑内小胶质细胞产生一系列免疫炎性和神经毒性因子，继而促进神经变性退行性疾病的发生和进展。BV-2细胞是国外学者培养出的永久分裂型的初生小鼠小胶质细胞，其与原代培养的小胶质细胞的形态及相关功能十分类似，特别是具有分泌炎性物质等功能。它培养较简单，目前被国内外许多学者应用于药理学、细胞吞噬作用、免疫学等研究领域。PC12细胞株源于大鼠嗜铬细胞瘤细胞，如正常的肾上腺髓质细胞一样，能合成、贮存多巴胺(DA)，又因该细胞含有的膜受体、酶类也类似大脑内的多巴胺能神经元，因此，PC12细胞成为学者们研究多巴胺能神经元的一种模型。虽然PC12细胞不能完全替代多巴胺神经元，但可以间接地作为基础研究提供参考的工具。
　　 本研究采用LPS激活BV-2细胞作为小胶质细胞体外炎症/免疫模型，损伤PC12细胞，旨在揭示SIRT1是否参与LPS激活小胶质细胞介导损伤多巴胺能神经元的过程之中及探索其中可能的作用机制。
　　 第一部分SIRT1对脂多糖活化BV-2细胞分泌IL-6和TNF-a的调节作用
　　 研究目的:
　　 观察LPS对BV-2细胞形状变化及白介素-6(IL-6)和TNF-a分泌情况的影响，探讨沉默信息调节因子1(SIRT1)在LPS诱导BV-2细胞释放前炎症因子过程中的作用。
　　 研究方法:
　　 1.BV-2细胞分为对照组及处理组，后者分为LPS组，白藜芦醇组及sirtinol组。对照组常规培养，LPS组分别加入不同浓度的LPS组(0.5、1、10、50、100μg/mL)、SIRT1激动剂白藜芦醇(10、25、50、100μmol/L)及SIRT1抑制剂sirtinol(1、2.5、5、10、25、50μmol/L)，分别作用24h，MTT法检测各组存活率。
　　 2.将BV-2细胞分为对照组、LPS组、白藜芦醇+LPS组、sirtinol+LPS组，根据MTT实验结果，选取适当浓度的LPS(1μg/mL)、白藜芦醇(10、25μmol/L)及sirtinol(25μmol/L)作用于BV-2细胞，分别用ELISA方法检测各组细胞相应处理6、12、24 h后上清液中的IL-6和TNF-a的含量。
　　 3.将BV-2细胞分为对照组、LPS组(1μg/mL)、白藜芦醇+LPS组(25μmol/L)、sirtinol+LPS组(25μmol/L)，Western blotting检测 SIRT1在上述各组细胞加药处理24 h后的表达水平。
　　 研究结果:
　　 1.显微镜下观察BV-2经LPS活化后的形态，MTT检测其细胞存活率
　　 从0.5μg/ml到100μg/ml，随着LPS浓度的增加，与对照组相比，细胞活性逐渐升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。对照组，BV-2细胞形态多样，以圆型、长梭型多见，核小，细胞一般都有1-2个细长的突起。脂多糖处理12小时后，细胞以肿胀圆型、多角型多见，胞体及细胞核明显增大，突起显著变短而突起数目增至3-4个。BV-2细胞激活前后，形状差异明显。
　　 2.不同浓度白藜芦醇、sirtinol对BV-2细胞存活率的影响
　　 随着白藜芦醇、sirtinol药物浓度的增加，细胞活力逐渐下。我们选择对BV-2细胞没有毒性作用的浓度为10μM、25μM的白藜芦醇，浓度为25μM的sirtinol进行下一步实验。
　　 3.白藜芦醇及sirtinol对BV-2细胞分泌细胞因子的调节作用
　　 与正常组相比，在6h、12 h、24 h时间点，LPS组IL-6、TNF-a分泌量明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05)。与LPS组相比，白藜芦醇(10μmol/L、25μmol/L)+LPS组的IL-6、TNF-a分泌量出现下降趋势，其中白藜芦醇浓度高的一组比浓度低的一组抑制效果更显著;相反，经sirtinol处理后，明显提高了IL-6、TNF-a的分泌量，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4.Western blotting检测各组SIRT1的表达
　　 LPS组SIRT1蛋白与对照组比较，蛋白表达量下降;白藜芦醇+LPS组与LPS组比较，蛋白表达量上升;sirtinol+LPS组与LPS组比较，蛋白表达量下降;各实验组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　 实验结论:
　　 LPS可显著改变BV-2细胞形状并诱导细胞前炎症因子的表达，干预SIRT1的表达量对上述现象有明显的调节作用。
　　 第二部分SIRT1在小胶质细胞激活介导多巴胺能神经元损伤中的保护作用
　　 研究目的:
　　 探讨SIRT1在小胶质细胞激活介导多巴胺能神经元损伤中所起的作用及相关机制。
　　 研究方法:
　　 1.分别收集BV-2细胞经常规培养基培养或LPS与BV-2细胞共培养上清作用16h后的上清。设立对照组和处理组，对照组加入单纯培养基200μl培养，处理组为1μg/ml LPS组、单纯BV-2细胞上清液组、LPS+BV-2细胞共培养上清组，分别加入含1μg/mlLPS的培养基、单纯BV-2细胞上清液、BV-2细胞与LPS共培养上清液各200μl培养24h，用MTT法检测上述各组PC12细胞的存活率。
　　 2.PC12细胞常规培养后，加入SIRT1激活剂白藜芦醇(5、10、25、50、100μM)、SIRT1抑制剂尼克酰胺(5、10、25、50mM)分别作用24h，MTT比色法筛选白藜芦醇(25、50μM)、尼克酰胺(10、25mM)用于下步实验进行干预的浓度。PC12细胞分为对照组、BV-2细胞+LPS共培养上清液组、白藜芦醇干预组和尼克酰胺干预组，对照组加入常规培养基培养，BV-2细胞+LPS共培养上清组加入BV-2细胞与LPS共培养上清液，后两组分别先加入白藜芦醇、尼克酰胺预处理2h后弃上清，再与添加等同浓度的白藜芦醇、尼克酰胺的BV-2细胞与LPS共培养上清液共培养。上述各组经培养6h后，Hoechst33258染色，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况;经培养18h后，MTT检测各组细胞活力，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blot检测细胞内SIRT1、乙酰化p53（acetyl-p53）、总p53(total p53)、caspase-3和caspase-3活化片段（cleaved caspase-3）的表达水平。
　　 研究结果:
　　 单纯LPS组、单纯BV-2细胞上清组与对照组比较，PC12细胞活力差异无统计学意义。1μg/mlLPS刺激BV-2细胞后，用此上清损伤PC12细胞，MTT法显示PC12细胞存活率下降，核染色及流式检测显示凋亡增多，Western blot显示SIRT1表达下降，乙酰化p53显著上调，caspase-3下降和cleaved caspase-3上升。加入白藜芦醇预处理后，较BV-2细胞+LPS共培养上清组，SIRT1表达回升，乙酰化p53下调，caspase-3上调和cleaved caspase-3下降，细胞存活率上升，凋亡率下降，另一方面，加入尼克酰胺预处理后，较BV-2细胞+LPS共培养上清组，所得结果与白藜芦醇预处理组相反。上述各组总p53的表达量差异无统计学意义。
　　 实验结论:
　　 在LPS与BV-2细胞共培养上清损伤多巴胺能神经元过程中，SIRT1很可能通过p53-caspase-3通路起保护作用。

目录

摘要

前言

第一部分 SIRT1对脂多糖活化BV-2细胞分泌IL-6和TNF-a的调节作用

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二部分 SIRT1在小胶质细胞激活介导多巴胺能神经元损伤中的保护作用及相关机制研究

1 材料和方法

2．结果

3 讨论

全文总结及展望

参考文献

综述

缩略表

攻读学位期间的成果

致谢

声明