克罗恩病与肠结核病理组织中胶原纤维差异性研究

摘要

克罗恩病(Crohn's disease，CD)是一种病因复杂、发病机制尚未明确的慢性非特异性炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)。目前该病诊断仍缺乏特异性方法。CD是欧洲和北美国家常见的消化系统疾病，而在发展中国家相对少见。但随着我国工业化、城市化进程加快，CD的发病率不断升高。肠结核(Intestinal tuberculosis，ITB)是结核分枝杆菌侵犯肠道引起的慢性特异性感染性疾病，是最常见的肺外结核病之一，其临床表现呈多样性，少数病例确诊困难。二者在临床表现上均可有不规则发热、腹痛、腹泻、便血及腹块，当病变早期局限于回盲部时，影像学表现及内镜下所见相似，甚至活检亦难以鉴别。有报道指出2种疾病相互误诊率高达50％～70％。由于CD和ITB的病因、治疗方法及预后均不同，因此，当ITB误诊为CD而使用激素或免疫抑制剂治疗时可导致结核病灶扩散;而当CD误诊为ITB使患者承受不必要的抗结核药物的毒副作用，延误CD的治疗可能导致一些本可避免的并发症的发生。因此，治疗前二者的鉴别诊断十分必要。
　　 在我国2007年炎症性肠病(IBD)诊断治疗规范的共识意见中，关于克罗恩病与肠结核鉴别的意见，当患者存在肛周病变、肠瘘、肠外表现、腹腔脓肿或便血等并发症、病变切除术后复发等特征之一或多种更多地考虑克罗恩病;而当患者存在活动性肠外结核或者活检见干酪性坏死肉芽肿才能有把握诊断肠结核。而目前国内外消化科医师主要通过对传统检查指标的量化、经验总结，来鉴别两者。联合临床表现、内镜特征、组织病理学特点进行探讨鉴别CD和肠结核的指标和方法，寻找预测鉴别CD和ITB的指标，旨在提高诊断的敏感性、特异性和准确性。但这只是临床综合推理和概率诊断，只有明确病因或发病机制才可能最终解决难于鉴别的难题。CD和ITB最关键的不同是病因的不同，因此鉴别的关键是找到结核杆菌。然而，传统的抗酸染色镜检和细菌培养阳性率极低，故价值不大。PCR技术的产生为两者鉴别提供了一种新方法，有研究发现在有肉芽肿而未发现干酪样坏死灶的肠结核活检组织中，PCR技术检测结核杆菌DNA的阳性率达71.4％，而同样形态的CD活检组织中无1例阳性。在一些仅见肉芽肿而找不到干酪样坏死灶的肠结核病例中，PCR技术对ITB和CD的鉴别诊断非常有价值。但PCR技术操作过程复杂，技术要求较高，操作过程中需严密防止“RNA酶”的污染，且引物设计的特异性选择同样也非常复杂，难以在临床上大规模应用。因此迫使我们积极寻找CD和ITB鉴别的更简单、经济、可行、更适合临床应用的方法。
　　 在克罗恩病和肠结核病变中，由于肠道组织对肠道慢性炎症过度刺激、不可逆应答形成了肠组织纤维化。病理表现为肠道肌层的过度生长，胶原组织的过度沉积，间质细胞过度生长。肠道受损时，固有层上皮下肌样成纤维细胞促进伤口的愈合，促进胶原的大量分泌以及细胞的增殖。胶原的过度沉积、间质细胞的过度增生会导致肠纤维化的发生。因此本研究拟比较克罗恩病和肠结核病变中肠道组织纤维化的特点，探索一种新的克罗恩病和肠结核的鉴别诊断方法。这将有助于克罗恩病和肠结核的鉴别诊断，并为进一步的临床治疗打下基础。但是肠道组织纤维化的评估却是一个难题，即使是目前公认的“金标准”肠道组织病理活检也有其局限性。传统病理对组织纤维化的判读是基于胶原纤维特殊性染色方法和病理医生的人为评估，客观性和重复性差。
　　 近年来非线性光学技术为研究组织内胶原纤维提供了全新的手段，广泛应用于生物医学研究中。二次谐波（second harmonic generation，SHG）显微成像技术最适合对非中心对称的分子进行成像，几乎所有类型的胶原纤维都能产生SHG信号，能特异性的显示胶原纤维及其三维形态;双光子激发荧光(two-photonexcited fluorescence，TPEF)则能显示细胞基质结构及胶原纤维沉积位置。1986年，Freund等首次将SHG用于老鼠尾腱的胶原纤维成像，其后，用于包括角膜、鼠尾肌腱和牛(I)型Achilles腱、人皮肤，还用于小鼠肾脏纤维化模型、大鼠肝脏纤维化模型、人肝纤维化研究，以及通过观察不同的胶原结构来鉴别良恶性肿瘤、肿瘤复发的早期诊断等。SHG获得的图像可由计算机处理、准确判读组织纤维化的程度。研究中还发现:不同因素导致的纤维化，纤维胶原的三维结构、沉积方式差异明显，通过纤维胶原三维结构来推断病因是一个值得探索的诊断途径。Jianxin Chen等运用SHG/TPEF技术观察正常胃和胃癌粘膜及粘膜下组织的特点，以期利用此项技术来提高胃癌的早期确诊率。但目前尚未有报道将该技术应用于检测结肠病变纤维化特点。
　　 国内外的研究显示，通过SHG/TPEF显微成像技术可以特异性显示组织中纤维性沉积的胶原蛋白，实现对非染色肝、肾组织纤维化的自动化评估，SHG/TPEF显微成像技术能够显示纤维素沉积的三维结构，可用来推测纤维化的病因。本研究通过对克罗恩病和肠结核临床病例的临床特点、内镜检查及病理标本回顾研究，总结两者不同的特征，寻找预测鉴别CD和ITB的指标，旨在提高诊断的敏感性、特异性和准确性。并通过应用传统病理技术（Masson's三染色）和SHG/TPEF显微成像技术，观察克罗恩病与肠结核纤维素沉积的特征，为两者的鉴别诊断探索一种新的方法。
　　 第一部分克罗恩病与肠结核临床、内镜及病理的对比分析
　　 目的:对比分析克罗恩病与肠结核的临床、内镜及病理特征，以期寻找预测鉴别CD和ITB的指标，提高两者诊断的准确率。
　　 材料和方法:采用回顾性方法，查找我院2006年至2012年确诊为克罗恩病、肠结核的病例资料，其中克罗恩病39例，肠结核34例。克罗恩病组:男性23例，女性13例，平均年龄:39.13±18.39岁;肠结核组:男性20例，女性14例，平均年龄:36.62±14.09岁。分别收集两组病例资料(1)一般资料:姓名、性别、年龄、地区（农村、城市）;(2)临床症状:腹痛、腹泻、便秘、血便、发热、盗汗、消瘦、腹水;(3)合并并发症:肠腔狭窄、肠梗阻、瘘管形成、肠外结核;(4)实验检查:血红蛋白、血沉、白蛋白、PPD试验;(5)内镜表现:粘膜充血水肿、糜烂、溃疡、纵形溃疡、环形溃疡、鹅卵石征、节段性改变、肠腔狭窄、假性息肉、粘膜桥、回盲瓣受累;(6)病理组织学:炎症、肉芽肿形成、干酪样肉芽肿、非干酪样肉芽肿、裂隙状溃疡、腺体增生。采用SPSS13.0软件进行分析，对克罗恩病和肠结核两组的病例资料进行比较，记数资料采用卡方检验，计量资料采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:(1)发病地区:克罗恩病集中在城市(61.5％)，肠结核好发于农村地区(64.7％)，P=0.025。(2)临床症状:血便克罗恩病组(17.9％，P=0.041)多见，出现盗汗（克罗恩病组7.7％（肠结核组29.4％，P=0.016）、腹水（克罗恩病组7.7％（肠结核组29.4％，P=0.016）支持诊断肠结核，腹痛(P=0.562)、腹泻(P=0.743)、便秘(P=0.380)、发热(P=0.244)、消瘦(P=0.541)在两组比较中均无统计学差异。(3)合并并发症:瘘管形成（克罗恩病组17.9％）肠结核组2.9％，P=0.041)支持诊断克罗恩病，肠外结核(克罗恩病组2.6％(肠结核组58.8％，P=0.000)支持诊断肠结核诊断，而肠腔狭窄(P=0.719)、肠梗阻(P=0.208)在两组比较中无统计学差异。(4)实验检查:血红蛋白（克罗恩病组108.46±19.01g/L（肠结核组111.81±19.17 g/L，P=0.458）、血沉（克罗恩病组37.71±19.98 mm/h）肠结核组31.91±17.45mm/h，P=0.194）、白蛋白（克罗恩病组33.47±7.87g/L）肠结核组31.91±17.45g/L，P=0.282）两组间比较均无统计学意义。(5)内镜表现:内镜下见纵形溃疡（克罗恩病组33.3％，肠结核组6.5％，P=0.008）、节段性改变（克罗恩病组48.5％，肠结核组9.7％，P=0.001）、假性息肉（克罗恩病组48.5％，肠结核组16.1％，P=0.006）及粘膜桥（克罗恩病组21.2％，肠结核组3.2％，P=0.030）较支持克罗恩病诊断，鹅卵石征（克罗恩病组21.2％，肠结核组0％，P=0.007）仅见于克罗恩病;环形溃疡（克罗恩病组12.1％，肠结核组41.9％，P=0.007）及回盲瓣受累（克罗恩病组51.5％，肠结核组77.4％，P=0.031）较支持肠结核诊断;粘膜充血水肿(P=0.854)、糜烂(P=0.955)、溃疡(P=0.894)、肠腔狭窄(P=0.362)两组间比较均无统计学差异。(6)病理组织学:裂隙样溃疡(14.3％，P=0.022)仅见于克罗恩病，干酪样肉芽肿(17.6％，P=0.009)仅见于肠结核，两组比较均有统计学差异。炎症(P=0.307)、肉芽肿形成(P=0.113)、非干酪样肉芽肿(P=0.733)、腺体增生(P=0.082)、肉芽组织形成(P=0.463)均无统计学差异。
　　 结论:克罗恩病与肠结核在临床症状、内镜及病理组织表现上非常相似，易误诊。鹅卵石征、裂隙状溃疡是克罗恩特征性表现，干酪样肉芽肿仅见于肠结核，但它们的出现率均较低，因此，单纯依靠内镜及病理组织鉴别两者，价值有限，仍需结合临床症状、实验室检查等综合判断。
　　 第二部分克罗恩病与肠结核病理组织中胶原纤维差异性分析
　　 目的:通过临床症状、内镜及病理组织的表现鉴别克罗恩病及肠结核仍存在较大的困难。不同病因导致的组织纤维性胶原三维结构差异明显。拟通过应用传统病理技术（Masson's三染色）和SHG/TPEF显微成像技术，观察克罗恩病与肠结核胶原纤维沉积的特征，为两者的鉴别诊断探索一种新的方法。
　　 材料和方法:选取我院确诊克罗恩病病理标本29例（内镜活检标本25例，手术标本4例），肠结核组病理标本14例（内镜活检组织12例，手术标本2例），健康对照组肠镜镜活检标本（取回盲部）11例。每份病理标本均连续切片3张，分别行HE染色、Masson's三染色、SHG/TPEF成像。采用Image-Pro Plus6.0软件分析Masson's三染色图片，计算平均吸光度(Average optical density, AOD)，平均吸光度=积分吸光度/（总面积一空白面积），以AOD来反映胶原纤维表达水平;测量积分面积(Area)，计算平均面积(Average area，Area)，平均面积=积分面积/(总面积-空白面积），以Area来反映胶原纤维沉积面积。观察SHG/TPEF成像图片胶原纤维沉积特点。运用SPSS13.0软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较，方差齐采用LSD-t法多重比较，若方差不齐，采用Dunnett's T3多重比较。对克罗恩病和肠结核两组组间进行比较，小样本采用Fisher精确概率法，计量资料采用t检验。均以P＜0.05为有统计学意义。
　　 结果:(1) Masson's三染色:在CD组、ITB组及健康对照组中，ITB组胶原纤维表达量最高（平均吸光度=560.1772±230.6484），胶原纤维沉积面积最大（1116.115±410.5037）。CD组、ITB组胶原纤维量及胶原沉积面积均高于健康对照组，且P均＜0.05。但CD组与ITB组比较，P＞0.05，无统计学差异。在剔除手术标本后，ITB组胶原纤维表达量及胶原面积均高于CD组，两组问比较，P＜0.05。在内镜活检标本中，有肉芽肿的标本中胶原纤维表达量（430.2869±187.6046）高于无肉芽肿（273.6598±243.2126）的标本，且两者比较有统计学差异(P＜0.05);有肉芽肿的胶原纤维面积（902.1117±379.9651）也明显大于无肉芽肿（557.4849±380.6856）的标本，两者比较有统计学差异(P＜0.05)。(2)SHG/TPEF成像:CD组与ITB组手术标本中均可见大量胶原纤维沉积在粘膜下层，其中CD组胶原纤维多呈簇状、卷发样分布，无明显规律;而ITB组可见胶原纤维在干酪样肉芽肿周围环形分布。两者在肠镜组织标本中，可发现胶原纤维在腺体周围散在分布。
　　 结论:在内镜活检标本中，肠结核胶原纤维表达量高于克罗恩病，有可能成为鉴别两者的新依据。肉芽肿的存在与肠纤维化存在相关关系。在肠镜活检标本中，肠结核肉芽肿检出率高于克罗恩病，这可能是导致肠结核胶原纤维表达量高于克罗恩病的一个原因。Masson染色及SHG/TPEF成像运用于评价克罗恩病与肠结核的纤维化是有价值的。

目录

摘要

第一部分 克罗恩病与肠结核临床、内镜及病理的对比分析

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 克罗恩病与肠结核病理组织中胶原纤维差异性分析

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

综述

中英文对照缩略词表

攻读学位期间发表的论文

致谢

声明