载有苯酰甲硝唑聚乳酸—羟基乙酸纳米粒硅橡胶制剂的应用基础研究

摘要

临床上，由口腔肿瘤、严重外伤及先天因素导致的上颌骨损伤，需要进行手术切除，达到彻底治疗的目的。但是，上颌骨切除后造成的上颌骨缺损，不仅影响患者的面部形态，而且还给患者带来严重的咀嚼、吞咽、语言等功能障碍，因此必须对缺损的上颌骨进行修复重建，使患者从生理上和心理上都得到较好的恢复。
　　 目前，在上颌骨修复重建中，普遍采用的是赝复体修复重建的方法。该方法具有创伤小、塑建性好、对缺损区肿瘤复查方便，同时能够较好地恢复患者的面部形态及咀嚼、吞咽、语言功能的优点。
　　 硅橡胶(silicone elastomer，SE)赝复材料，具有毒性小、机械性能好的特点，被广泛应用于赝复体的制作，是目前颌面部组织缺损修复的首选材料。但是，硅橡胶具有称量（质量）大的特点，影响手术中及患者使用时的固位性，出现移位后，需要不断地校正复位，保证患者的正常生活。但是，反复操作增加了患者的痛苦，给患者造成了极大的不便，影响愈后效果。另外，硅橡胶表面抛光打磨困难，其自身细胞毒性又小，为细菌等病原微生物的滋生、繁殖提供了有利条件，增加了口腔炎症的发生机会;而病原微生物侵入到赝复体内部后，会侵蚀、降解赝复体，进而缩短赝复体的使用寿命。
　　 载药纳米粒是由天然（或合成）的高分子材料，包裹固态或液态药物构成的粒径小于1μm的微小球状实体。目前，在药学领域中，用作制备载药纳米粒的载体材料有很多种，主要包括壳聚糖、聚乳酸、聚羟基丁酸酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)具有生物相容性良好、体内可生物降解的特点，广泛用于药物缓释制剂的研究，另外，PLGA的体内代谢产物主要为水和二氧化碳，具有不引起机体炎症反应、免疫反应和细胞毒性反应的优点。目前，进入市场销售的PLGA纳米粒制剂主要有: WHO批准的一次性注射疫苗—破伤风类毒素PLGA纳米粒注射剂;第一个多肽类PLGA控释纳米粒注射剂—黄体酮生成素释放激素—Triptorelin-PLGA纳米粒注射剂;日本武田公司开发的Leuproreling等。
　　 目前，有学者将中空微球加入到硅橡胶中，对硅橡胶进行改性，发现将中空微球加入到硅橡胶后，能够显著降低硅橡胶密度，同时对硅橡胶的物理机械性能也有一定的改善。因此，课题组设想，将目标抗生素制备成载药纳米粒，再填充到硅橡胶中，以制备出具有一定抗菌活性的轻质、新型硅橡胶制剂，扩大硅橡胶的临床应用范围。
　　 临床常见的口腔炎症，是由多种病原微生物引起的，而具核梭杆菌是其中的一种主要致病菌，该细菌是一种无芽胞的条件致病型厌氧杆菌，革兰氏染色呈阴性。在对上颌骨缺损组织进行赝复体植入修复治疗后，具核梭杆菌的聚集位置会向赝复体表面转移，尤其是在患者术后抵抗力下降时，致病性更强，易引起口腔炎症的发生。具核梭杆菌不仅能促进细菌生物膜的形成，增加细菌的致病性，而且能促进单核细胞的促炎细胞因子释放，提高NF-κ-B因子的活性，严重时，还会诱导牙槽骨损失，降低骨组织的密度，影响患者愈后效果。
　　 苯酰甲硝唑（metronidazole benzoate，MEB）是硝基咪唑类抗生素，主要用于治疗厌氧菌引起的感染性疾病。苯酰甲硝唑具有无味、脂溶性好、抗菌谱广的特点，对梭杆菌属（包括具核梭杆菌、坏死梭杆菌和微生子梭杆菌等）、脆弱类杆菌群属（脆弱类杆菌、吉氏类杆菌、普通类杆菌和多形类杆菌等）、真杆菌属（包括粘液真杆菌）都有抗菌作用。目前，英国、美国、日本已经将苯酰甲硝唑收录进药典，用于治疗厌氧菌引起的感染。在中国也有苯酰甲硝唑胶囊剂、片剂、干混悬剂销售。
　　 综上所述，课题组设想制备一种载有苯酰甲硝唑聚乳酸-羟基乙酸纳米粒的硅橡胶制剂(metronidazole benzoate-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nano-particles silicon elastomer, MEB-PLGA-Nps-SE)，以期开发出质轻、具长期抗菌活性的新型硅橡胶赝复材料，提高硅橡胶赝复体的固位性以及减少口腔炎症的发生机会，从而扩大硅橡胶的应用范围，提高患者的生活质量。该设想主要基于两方面考虑，一是将制备的轻质PLGA纳米粒填充到硅橡胶中，达到对硅橡胶的改性，使硅橡胶具有一定抗菌活性;二是利用纳米粒的密度小、空间大的特点，达到减小硅橡胶密度的效果，同时利用PLGA的缓慢降解性质，进而对苯酰甲硝唑起到缓释的作用，同时在硅橡胶的作用下对药物进行“二次”缓释，达到避免药物“突释”，延长药效时间的目的。
　　 基于上述目的，本文主要进行以下几个方面的研究。
　　 根据MEB和PLGA的物理性质，课题组设计采用单相乳化-溶剂挥发法制备苯酰甲硝唑聚乳酸-羟基乙酸纳米粒(MEB-PLGA-NPs)。在研究初期，首先进行MEB-PLGA-NPs处方前研究，包括:确定MEB的最大吸收波长、优化MEB-PLGA-NPs中MEB的含量测定方法、载药量、包封率测定方法和冻干工艺的确定。在此基础上，以载药量为指标，通过对MEB用量、载体材料PLGA用量、表面活性剂PVA浓度、搅拌速度、油相与水相比例等进行单因素考察，研究MEB-PLGA-NPs的制备处方和制备工艺。再通过正交设计优化处方和制备工艺。采用最佳处方工艺制备得到三批MEB-PLGA-NPs，各批次样品复溶性好，呈白色流动性好的粉末状产物，其载药量为3.59±0.15％，包封率为39.52±1.65％，粒径为312.03±12.77 nm。体外释放考察结果显示，实验中制备的MEB-PLGA-NPs呈现明显的缓释现象，在考察24 h时，药物的累积释放度为29.03±2.66％;120 h时达到49.70±4.08％;240 h时，达到最高55.60±5.01％。
　　 实验中通过采用改良的硅橡胶制各方法，分别将不同质量比(W/W)的(0％、0.2％、0.4％、0.8％、1.2％)苯酰甲硝唑(和自制的10％、20％、30％ MEB-PLGA-NPs)填充到硅橡胶中，制备得到苯酰甲硝唑硅橡胶(metronidazole benzoate-siliconeelastomer, MEB-SE)制剂（和MEB-PLGA-NPs-SE制剂）。实验中制备的硅橡胶制剂表面光滑，无气泡残留，经扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)分析，填充物在硅橡胶制剂中分散均匀，且随着填充物投入量的增加，硅橡胶制剂中的填充物颗粒呈现增多的趋势。参考相关文献，对硅橡胶制剂进行药物含量分析，结果显示，测得的各实验组含药量占标示量的范围在97％-104％。对1.2％ MEB-SE制剂和30％ MEB-PLGA-NPs-SE制剂的体外释放考察结果分析，显示实验中制备的MEB-PLGA-NPs-SE制剂对苯酰甲硝唑具有更为明显的缓释作用。
　　 按照NCCLS药敏扩散法法规，对实验中制得的各组硅橡胶制剂进行了对具核梭杆菌ATCC10953的抗菌活性评价。结果显示各实验组（MEB-SE制剂或MEB-PLGA-NPs-SE制剂）对具核梭杆菌具有明显的抗菌活性，其中30％MEB-PLGA-NPs-SE对具核梭杆菌的抑菌环为22.10±0.17mm，并且各组之间有显著性差异。按照ISO10993-12:2002，对实验中制得的各组硅橡胶制剂进行了细胞毒性考察。结果显示在考察的24 h、48 h和72 h时，各组的细胞毒性分级均在1级以下，按照细胞毒性判别标准，均达到合格的要求。
　　 赝复体植入口腔后，在患者咀嚼、吞咽和说话时，在各个方向作用下，会对其自身的物理机械性能会产生影响。因此，有必要对硅橡胶制剂的物理机械性能进行考察，为进一步的研究提供依据。本研究中按照ISO37:2005标准对各组硅橡胶制剂进行拉伸强度和拉断伸长率考察，结果显示，随着MEB(或MEB-PLGA-NPs)填充量的加大，对拉伸强度有显著性影响，而各组对拉断伸长率没有显著影响。按照ISO34-1:2004标准对各组硅橡胶制剂进行了撕裂强度考察，结果显示，随着填充物MEB(或MEB-PLGA-NPs)的增加，撕裂强度呈减小的趋势，当MEB-PLGA-NPs填充量达到20％时，对撕裂强度有显著性影响。按照ISO7619-1:2004标准对各组硅橡胶制剂进行了邵氏A硬度考察，结果显示，随着MEB(或MEB-PLGA-NPs)的加入，邵氏A硬度呈增加的趋势，各硅橡胶制剂组与空白硅橡胶组比，均有显著性差异。按照GB9891-88标准对各组硅橡胶制剂进行了密度考察，结果显示，随着MEB(或MEB-PLGA-NPs)的加入，硅橡胶密度呈减小的趋势，当MEB-PLGA-NPs填充量达到20％时，对硅橡胶密度有显著性影响。
　　 综上所述，本课题组制备得到了一种具有抗具核梭杆菌ATCC10953活性、质轻、对苯酰甲硝唑缓释的新型硅橡胶制剂。实验中采用单相乳化-溶剂挥发法制备的MEB-PLGA-NPs粒径大小、分布均一，电镜下观察为圆形或类圆形，均一性较好，经冻干处理后，得到复溶性好、流动性好的白色粉末状产物。体外释放研究证实，实验中制备的MEB-PLGA-NPs对苯酰甲硝唑具有明显的缓释作用;而实验中制备的MEB-PLGA-NPs-SE制剂对苯酰甲硝唑具有更为明显的缓释作用。抗具核梭杆菌实验表明，30％ MEB-PLGA-NPs-SE对具核梭杆菌ATCC10953的抑菌环为22.10±0.17 mm，能够达到对具核梭杆菌ATCC10953的有效杀菌作用，结合30％ MEB-PLGA-NPs-SE的体外释放结果，可以推断MEB-PLGA-NPs-SE具有长期抗具核梭杆菌的潜力。细胞毒性实验，显示各组硅橡胶制剂的细胞毒性分级均为合格。物理机械性能考察表明，MEB(或MEB-PLGA-NPs)填充量的不同，对硅橡胶制剂的物理机械性能有不同的影响，其中对密度减小的作用随填充量的加大更为显著，30％ MEB-PLGA-NPs-SE制剂组密度为0.967 g/cm3，实验中制备的MEB-PLGA-NPs可以达到减轻硅橡胶质量的目的。

目录

摘要

前言

第一章 苯酰甲硝唑聚乳酸-羟基乙酸纳米粒的制备

1．1 材料与仪器

1．2 方法

1．3 结果

1．4 讨论

第二章 载有苯酰甲硝唑聚乳酸-羟基乙酸纳米粒硅橡胶制剂的制备及体外释放考察

2．1 材料与仪器

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 载有苯酰甲硝唑聚乳酸-羟基乙酸纳米粒硅橡胶制剂的抗菌活性及细胞毒性研究

3．1 材料与仪器

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 载有苯酰甲硝唑聚乳酸-羟基乙酸纳米粒硅橡胶制剂的物理机械性能研究

4．1 材料与仪器

4．2 方法

4．3 结果

4．4 讨论

全文总结

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢

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