谷维素与黄连素联合应用的药效学及药动学研究

摘要

世界卫生组织(WHO)统计显示高胆固醇血症占心血管疾病的56％，每年均有4.4百万人死于高胆固醇血症。
　　 目前用于调脂的药物有他汀类（即HMG-CoA还原酶抑制剂）、贝特类、烟酸、胆酸脂螯合剂等四大类，其中临床实际应用最多的主要是他汀类和贝特类，但大剂量应用他汀类可使肝转氨酶升高、肌痛及肌炎，若与贝特类药物联合应用更可能引起严重的肌炎及横纹肌溶解，甚至发生急性肾功能衰竭;单独应用贝特类药物容易引起胃肠道不适及偶见皮肤瘙痒、荨麻疹、皮疹、脱发、头痛、失眠和性欲减退等，长期服用可导致肝、肾功能损害。其次，上述两种药物价格昂贵，对于需要长期服药的患者而言无疑是一种严重的经济负担。因此，研发一种安全、有效、经济的降脂药具有重要意义。
　　 黄连素(Berberine，BBR)常用于肠道感染;谷维素(Oryzanol，OZ)主要改善自主神经功能，可减少内分泌紊乱，改善精神神经失调症状。临床及体内外实验证明两者均有显著降血脂作用且临床应用安全有效。BBR与目前临床上使用的调脂类药物作用机理明显不同，它是在基因转录后水平上，通过作用于3'UTR区域，稳定及增加低密度脂蛋白受体的mRNA并提高其受体蛋白，提高密度脂蛋白的代谢从而达到降低血脂的目的。OZ则通过抑制体内过氧化脂的产生、改变胆固醇酯酶和酰基辅酶的活力，降低胆固醇合成，增加胆固醇和胆酸排除，最终降低血脂浓度。虽然两者降脂机制不同，但合用后具有明显的协同作用，可降低各自的用药剂量，减轻长期用药带来的毒副作用，同时OZ可以促进BBR的吸收，提高BBR生物利用度。
　　 因此，本课题以BBR与OZ为研究对象，运用紫外分光光度法、液质联用等方法进行药学、药效学及药动学方面的系列研究。首先拟建立一种简便、重现性好、可靠的含量测定方法同时测定BBR及OZ的含量，为后期制剂研发提供质控方法。同时建立高血脂动物模型研究BBR与OZ联用的降脂效果，结合药动学实验考察比较BBR、OZ单独与联合使用后在大鼠体内药动学过程的变化，从药动学层面探讨BBR与OZ产生协同降脂作用的机理。另外，由于OZ溶解度低，吸收差，生物利用度(BA)低，本课题亦分别从体外及体内考察吐温-80(TW-80)对OZ的增溶作用，为提高OZ生物利用度提供实验依据。
　　 目的:1.含量测定。初步建立BBR与OZ的含量测定方法，为后期制剂的研究开发提供实验基础。
　　 2.药效学实验。建立高血脂大鼠模型，筛查BBR与OZ合用后降脂效果的最佳处方。
　　 3.药动学实验。通过药动学实验，考察比较BBR、OZ单用与合用后在大鼠体内的吸收、分布、消除等参数的变化情况，探讨BBR与OZ的协同作用机理，从药动学角度阐明两药合用后协同降脂的作用机制。
　　 4.OZ增溶作用初步研究。通过体内外实验考察TW-80对OZ的增溶作用。
　　 方法:1.参考《中国药典》2010版、卫生部部颁标准及相关文献，采用双波长紫外分光光度法同时测定BBR及OZ含量，并进行方法学考察。实验选定OZ的测定波长为304nm，参比波长为369nm，BBR的测定波长为430nm;通过BBR、OZ对照品建立标准曲线计算两药的含量。
　　 2.药效学实验:建立高血脂大鼠模型及降脂效果考察
　　 96只Wistar雄性大鼠适应性饲养1周，随机取8只作为正常对照组，给予普通饲料，其余大鼠给予高脂饲料，4周后通过眼眶取血，检测血清生化指标(总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)，根据血清TC值将大鼠随机分为高血脂模型组（高脂饲料）、阳性对照组（高脂饲料+洛伐他汀组）及BBR单药Ⅰ(0.01 g·kg-1)、BBRⅡ(0.03 g·kg-1)、BBRⅢ(0.1 g·kg-1)，OZ单药Ⅰ(0.01 g·kg-1)、OZⅡ(0.03 g·kg-1)、OZⅢ(0.1 g·kg-1)、复方Ⅰ组(BBR0.025 g·kg-1+OZ0.005 g·kg-1)，复方Ⅱ组(BBR0.02 g·kg-1+OZ0.01 g·kg-1)、复方Ⅲ组(BBR0.015 g·kg-1+OZ0.015 g·kg-1)。高血脂模型组及正常对照组每天灌胃(ig)给予生理盐水，其余各组连续给药4周，收集血清分别检测TC、TG、LDL-C及HDL-C水平，考察BBR、OZ单用及联用后的降脂效果。
　　 3.药动学实验
　　 取正常SD大鼠24只，体重(250-320g)，适应性饲养一周后，禁食12h，自由饮水，随机分为4组，雌雄各半，分别以100 mg·kg-1(0.5％CMC-Na混悬)灌胃量给予大鼠OZ及BBR+OZ、TW-80+OZ2，5，10，20，30，60，120，180，240，360，480及720 min后，给予BBR5，10，20，30，60，120，180，240，360，480，720及1440 min后，进行眼底静脉丛取血(400μL)，肝素钠抗凝，4000 r·min-14℃离心10min，精密量取100μL上清血浆置另一EP管中，-80℃冰箱保存待测。血样经过前处理后，采用液质联用(LC/MS/MS)仪测定血浆中BBR与阿魏酸(Femlic，FA)的含量。测定结果用DAS2.0软件进行分析，以拟合度和AIC值作为判断标准，选择适当的房室模型，计算药动学参数。
　　 4.OZ增溶作用初步研究。
　　 称取适量OZ，体外采用0.1 mol·L-1 HC1、pH6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)以模拟胃液与肠液。用含有不同浓度TW-80的0.1 mol·L-1 HCl或PBS溶解，紫外分光光度计(UV-Vis)测定OZ在329nm波长处的吸光度，通过吸光度的变化考察TW-80对OZ的增溶效果。体内通过药动学实验考察添加TW-80后OZ的药动学变化，从药动学角度考察TW-80对OZ的增溶效果。
　　 结果:1.含量测定方法的测定
　　 OZ和BBR的线性范围和相关系数分别为2.93～52.8 mg·L-1，R2=0.9999;2.1～37.8mg·L-1，R2=1.0000。对应的平均回收率和RSD为98.69％，2.36％(n=6);101.79％，2.01％（n=6）。
　　 2.药效学实验，高血脂大鼠模型的建立及降脂效果考察
　　 给予Wistar雄性大鼠高脂饲料4周，采用全自动生化分析仪检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，建立高血脂大鼠模型:与空白对照组比较，高血脂模型组中TC、LDL-C均显著升高(P＜0.05），而HDL-C/TC(H/T)比值显著降低(P＜0.05），模型复制成功;后给药4周，检测各项血脂指标，观察药物降脂效果:单药Ⅱ、Ⅲ组，用药前后对比，各指标均有明显改善，但Ⅱ与Ⅲ组之间的疗效并无显著差异。因此，综合分析，BBRⅡ、OZⅡ的剂量最为合适，既有明显疗效，同时剂量相对较小。三种复方降脂药均有疗效，且效果相近;复方各组与单药Ⅱ组及阳性组比较，疗效虽无明显差异，但从药量分析，复方中各单药用量比单药组低，理论上降低毒副作用。复方Ⅰ中，BBR为单药剂量5/6，OZ为1/6;复方Ⅱ中，将两药降至单药剂量的一半;复方Ⅲ中BBR仅为单药剂量的1/3，OZ为2/3。三组复方具有较好的疗效。
　　 3.药动学实验
　　 在电喷雾离子源ESI(-)及ESI(+)离子化条件下，采用多反应监测(MRM)模式分别检测FA(m/z193-＞134)及BBR(m/z336-＞292)。FA在3.082-400.32 ng·mL-1范围内(R2=0.9957)、BBR在5.008-127.2 ng·mL-1范围内(R2=0.9981)呈良好线性关系。口服给药后，BBR及OZ在大鼠体内符合二室开放模型;单用和配伍给药后，各药动学参数均具有明显统计学差异。两者配伍给药后，FA t1/2β值(399.61+85.67)，Cmax值(285.65±57.16)及AUC0-∞值(79803.02±5757.05)均显著高于单药组中t1/2β值(197.74±54.84)， Cmax值(166.93±54.70)及AUC0-∞值(40420.60±15773.44);相应的，BBR的Cmax值(66.90±18.49)及AUC0-∞值(26606.41±3897.89)均高于单药组中Cmax值(65.99±13.34)及AUC0-t值(19197.90±2763.47)，但t1/2β值(351.80±71.35)低于单药组中t1/2β值(561.42±97.19)。表明两药联合应用后，FA分布加快，消除减慢，吸收增加，生物利用度提高;BBR分布减慢，消除加快，吸收增加，生物利用度提高。
　　 4.OZ增溶作用初步研究
　　 体外TW-80对OZ的增溶作用呈浓度依赖性(TW-80浓度为0～1％)。体内药动学实验结果表明，添加TW-80后，虽然FA的吸收并无提高，但Tmax延长、AUC0-∞显著升高，提示TW-80能延长OZ的吸收及分布，提高OZ的生物利用度。
　　 结论:双波长紫外分光光度法可同时测定BBR与OZ含量的测定及其质量控制方法。通过药效实验证明BBR联合OZ可产生明显的协同降脂作用，两药合用可减少BBR与OZ的用量，从理论上减少了大剂量单药带来的副作用。为进一步研究BBR与OZ合用协同降脂的作用机制，通过药动学实验分析BBR、OZ及两药合用后的药动学变化，结果表明两药合用后可显著影响各自的吸收、分布、代谢与消除，具有明显的药动学相互作用，提示两药合用协同降脂的机制与两药相互促进吸收有关。同时，发现TW-80能显著提高OZ的溶解度，并延长OZ的吸收及分布，提高OZ的生物利用度，表明TW-80可作为OZ的增溶剂。

目录

摘要

前言

第一章 初步建立谷维素及黄连素的含量测定方法

1．仪器和试剂

2 方法

3 结果

4 讨论与结论

第二章 药效学实验

1 材料与仪器

2 方法

3 结果

4 讨论与结论

第三章 药动学实验

1 材料与仪器

2 方法

3 结果

4 结论与讨论

全文总结

参考文献

综述

中英文对照缩略词表

攻读硕士期间发表的论文

致谢

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