大鼠脑缺血后大脑皮层长链非编码RNA的表达谱研究

摘要

研究背景:
　　 脑卒中是以脑部缺血及出血性损伤症状为主要临床表现的疾病，俗称脑中风。脑卒中具有极高的病死率和致残率，其中缺血性脑梗塞约占中风发病率的85％。全球每年约有600万人死于脑卒中，是全世界导致死亡的第二病因。根据世界卫生组织统计，我国脑卒中发生率正以每年8.7％的速度上升，比美国高出一倍，每年约新增130万例脑血管病、死亡近100万人，已成为居民第一位死亡原因。幸存者中约3/4的人留下偏瘫等后遗症状，部分病人丧失劳动能力和生活能力，给家庭带来沉重的经济负担和精神压力，给社会带来的经济损失达400多亿元（中国疾病预防控制中心，2012）。因此，脑卒中的预防和治疗已成为现代医学科学研究的重大课题之一。
　　 近几十年来，虽然大量科研人员致力于脑缺血后病理损伤机制的研究，但目前仍未完全阐明。针对脑缺血病理损伤机制中的某个靶点开发的治疗候选药物的临床试验疗效都不理想，导致临床试验失败的主要原因是脑缺血后的病理损伤机制复杂以及各种损伤机制之间的级联和网络关系尚不明确，因此，针对某个靶点的研究策略也受到了质疑。目前还没有一种候选药物能同时针对多种损伤机制而发挥减轻脑缺血后损伤的作用，从而降低脑缺血患者的致残率，减轻后遗症。通过新机制研究发现新的治疗靶点是科研人员一直努力的方向。
　　 近年来，高通量技术和生物信息学分析技术越来越多的应用于解决生物学问题，尤其是应用于人类疾病的研究。这种以数据为导向，大规模、工业化、整体化的研究模式，使得从基因组(Genomics)水平、转录组((Transcriptomics)水平、蛋白质组(Proteomics)水平对疾病展开全方位、多层次的研究和分析成为可能。转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带，转录组研究已经成为揭示疾病基因变化规律、疾病发生发展机制、发现致病基因关键调控靶点等领域的最佳研究手段，广泛应用于疾病预防、诊断、个性化治疗和预后等领域。
　　 大量新近的实验结果表明，真核生物中存在着大量来源于非编码DNA的转录产物——“非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)”，它们不仅数量众多，是生命活动的重要信息载体，并且能在多种生命活动中发挥重要的调控作用，是转录组学研究的重要组成部分，也使人类对基因组的认识和研究上升到了更加深入的领域。在过去的几年里，非编码RNA研究取得了很大的进步，但大部分工作都集中在microRNA(miRNA)等小分子非编码RNA，对于长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNAs)的研究相对较少。lncRNAs是一类转录本长度超过200nt，但并不编码蛋白或者只是编码很短多肽的基因转录产物，它们以RNA的形式在多种层面上发挥调节作用，如基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录后调控，蛋白功能调节等。正因为lncRNAs广泛的分子生物学功能，lncRNAs可从多方面调控基因，从而发挥多靶点的作用，为探讨复杂疾病的病理机制提供了一个新的研究领域。lncRNAs与疾病之间的关系已得到越来越多的关注，lncRNAs在肿瘤，神经退行性疾病中的研究结果显示，lncRNAs有望成为疾病诊断和预后的分子标志物，在疾病治疗方面也有望成为同时针对多个蛋白和信号通路的治疗靶点。
　　 microRNA水平探讨脑缺血后病理损伤机制已有报导，而且随着研究的深入，一些脑缺血诱导的特异性miRNA，如miRNA-233，miR-497具有神经元保护作用，可以作为很有希望的治疗靶点。相对于microRNA，lncRNAs在缺血性脑卒中的研究较少，国外仅有一篇关于脑缺血后lncRNAs的研究报导，且该研究仅处在初步的数据积累阶段，并未对脑缺血诱导的lncRNAs在病理损伤级联过程中的可能作用进行深入分析和探讨。影响脑缺血后病理过程的因素较多，如缺血时间、缺血后时间长短等，因此有必要对脑缺血后lncRNAs的表达情况进行更全面的研究。
　　 本课题猜想:(1)鉴于lncRNAs在细胞内具有广泛的生物学功能，lncRNAs在脑卒中损伤级联中必有重要作用;(2)高通量芯片技术的完善，使我们可以在基因组全局水平研究与疾病相关的分子机制，通过研究缺血性脑卒中lncRNAs的表达情况，开启我们对脑缺血后损伤机制研究的另一个新领域，使我们对脑缺血损伤机制的认识上升到更高水平;(3)对比脑缺血模型大鼠大脑缺血半影区与假手术模型大鼠大脑相同部位lncRNAs的表达谱，筛选出脑缺血诱导的、特异性表达的lncRNAs;(4)通过构建lncRNAs-mRNAs共表达网络、基因位点分析、KEGG通路分析及GO分析等生物信息学分析技术，分析大脑皮层缺血半影区差异表达的lncRNAs在缺血性脑卒中后损伤级联中的可能作用，筛选出候选研究目的lncRNAs，为研究缺血性脑卒中损伤的lncRNAs机制及发现新的治疗靶点奠定基础。
　　 研究目的:
　　 (1)我们采用大鼠局部脑缺血再灌注损伤模型模拟缺血性脑卒中，假手术组做对照，通过高通量芯片研究大脑皮层缺血半影区lncRNAs表达谱，筛选出差异表达lncRNAs。
　　 (2)通过生物信息学分析技术，进一步分析差异lncRNAs在脑卒中后病理损伤级联过程中的可能作用，筛选出脑缺血后病理损伤过程中具有潜在关键调控作用的lncRNAs。
　　 (3)为了进一步验证实验结果的可重复性和芯片结果的可靠性，同时为了排除手术操作时动物应激反应的影响因素，我们采用一组新样本，并设立正常对照组，使用RT-PCR进行验证，明确候选研究lncRNAs的表达情况，为进一步研究候选目的lncRNAs的功能和机制奠定基础，为寻找新的治疗靶点提供科学依据。
　　 研究内容:
　　 第一章局部脑缺血再灌注模型大鼠大脑皮层lncRNAs表达谱研究
　　 目的:
　　 缺血性脑卒中病理损伤过程中lncRNAs表达谱已有研究，但由于实验动物物种的不同、取样部位差异或取样时间点、实验技术平台的不同，实验结果会存在较大差别。通过高通量芯片技术研究局部脑缺血再灌注损伤模型大鼠大脑缺血半影区和假手术大鼠大脑相同部位组织lncRNAs的表达谱，筛选差异表达的lncRNAs，为脑缺血诱导的lncRNAs提供数据积累。
　　 方法:
　　 建立局部脑缺血再灌注损伤大鼠模型(N=3)，缺血1h，再灌注24h;假手术组做对照(N=3)。分别提取模型组缺血半影区和假手术组相同部位脑组织的总RNA，纯化，检验RNA质量后，合成生物素标记的cRNA。利用美国Arraystar公司大鼠lncRNAs芯片技术检测各组lncRNAs和mRNAs的表达情况，对原始数据进行预处理、均一化后进行统计学分析。对比模型组与假手术组数据，以2倍以上变化且具有统计学意义(P＜0.05）为判断标准，筛选出差异表达的lncRNAs和mRNAs。对差异表达的mRNAs进行GO分析和KEGG通路分析。
　　 结果:
　　 美国Arraystar公司大鼠lncRNAs芯片共包含9300个lncRNAs探针和15200个mRNAs探针，因此在检测lncRNAs表达谱的同时也检测了mRNAs的表达谱。对芯片原始数据进行标准化处理和两组比较后，差异表达的lncRNAs为1213个，占检测lncRNAs的13.04％，其中上调373个，下调840个;5倍以上变化的共101个，其中上调65个，下调36个;10倍以上变化的共18个，其中上调14个，下调4个。
　　 差异表达的mRNAs共1894个，占检测mRNAs的12.46％，其中上调1081个，下调813个;5倍以上变化的mRNAs共346个，上调289个，下调57个;其中6个mRNAs（Ref-Seq ID号），NM_001007612，NM_001109536，NM031530，NM012953，NM030845，NM012620上调100倍以上。
　　 结论:
　　 局部脑缺血后大鼠大脑皮层缺血半影区lncRNAs和mRNAs表达谱发生了显著变化。部分差异表达的mRNAs与已有的研究结果相同，GO分析和KEGG通路分析发现，差异表达的mRNAs主要与炎症反应和免疫反应有关，这与已知的脑卒中的病理损伤过程相符，在一定程度上说明了芯片结果的可靠性，可对筛选得到的差异lncRNAs进行后续分析。
　　 第二章生物信息学分析技术挑选研究目的基因
　　 目的:
　　 高通量芯片筛选出1213个差异表达的lncRNAs和1894个差异表达的mRNAs，由于lncRNAs的相关研究资料有限，不能为挑选候选研究的lncRNAs提供参考，发现与研究目的密切相关的lncRNAs是一个挑战。通过构建lncRNAs-mRNAs共表达网络、基因位点分析等一系列生物信息学分析技术，发现在脑缺血病理损伤进程中起关键作用的lncRNAs，作为深入研究的候选基因。
　　 方法:
　　 生物在不同状态下，基因的表达情况不同，基因间的相互关系也不同。不同的子网络模块必然与生物当前的功能状态密切相关。通过权重基因共表达网络分析法(Weighted Correlation Network Analysis)构建差异基因的lncRNAs-mRNAs共表达网络。比较模型组和假手术组各自的lncRNAs-mRNAs共表达网络，可发现同一基因在不同网络中与其他基因的关联程度不同，包括关联的基因个数不同，关联的基因也可能不同。因此，根据基因在模型组和假手术组中的关联度差异，以关联度差异≥0.5为判断标准，筛选出关联度差异较大的lncRNAs。
　　 分析关联差异较大lncRNAs的子网络，根据lncRNAs关联mRNAs的功能，大致推断lncRNAs与脑缺血后病理损伤的密切性。因为lncRNAs发挥作用的机制可能与lncRNAs邻近的蛋白编码RNA有关，因此再对lncRNAs的基因位点进行分析，最终选定研究目的lncRNAs。
　　 结果:
　　 模型组和假手术组lncRNAs-mRNAs共表达网络的结构和形状有很大差别，说明脑缺血病理组织和假手术组织中mRNAs和lncRNAs的共表达关系几乎完全不一样。比较两组网络中相同基因度的变化，以模型组与假手术组差异≥0.5为标准，共筛选出205个lncRNAs，其中上调41个，下调164个。子网络分析和基因位点再分析后，最后确定BC168687， BC081976，MRAK16399，MRAK051903作为后续研究的目的lncRNAs。
　　 结论:
　　 通过构建lncRNAs-mRNAs基因共表达网络联合基因位点分析的方法，能从大量芯片结果中挑选出与研究目的密切相关的lncRNAs，这为芯片结果的进一步挑选提供了新方法。通过生物信息学分析方法挑选的研究目的lncRNAs-BC168687，BC081976，MRAK16399，MRAK051903具有很好的研究前景。
　　 第三章实验结果及研究目的基因的RT-PCR验证
　　 目的:
　　 为了进一步证明芯片实验结果的可靠性和可重复性，同时为了排除模型制作时大鼠的应激反应引起候选lncRNAs改变的可能性，我们采用一组新的大鼠脑缺血模型和假手术标本，并同时设立正常大鼠对照组，对4个研究目的lncRNAs及其他5个lncRNAs进行RT-PCR验证，明确基因的表达情况。
　　 方法:
　　 建立大鼠局部脑缺血再灌注损伤模型(N=3)，假手术组(N=3)和正常组(N=3)。取大脑皮层相同部位组织，提取RNA，测定RNA的浓度和纯度。设计待验证lncRNAs的逆转录引物和PCR扩增引物，GAPDH作为内参。提取的RNA用特异设计的引物进行逆转录，反应后得到的cDNA溶液用于PCR扩增，每个样本重复三次，每次三个复孔。以正常组为对照，采用2-△△Ct法计算各基因的相对表达量。用SPSS16.0统计软件对各组目的基因的2-△△Ct进行统计分析，采用方差分析对样本间的均数进行比较。数据方差齐性检验，如Levene检验方差齐性(P＞0.05)，组间比较采用one-way ANOVA、组间多重比较采用LSD分析;如果方差不齐(P＜0.05)，组间比较则选择方差不齐的近似F检验Welch法、组间多重比较采用Dunnett T3法分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 对各组目的基因的2-△△Ct进行统计分析。lncRNAs-MRAK045258:方差分析结果表明模型组、假手术组和正常对照组之间差异有统计学意义(F=242.468，P＜0.001)。模型组与正常对照组相比差异有统计学意义(P＜0.001)，模型组与假手术组相比差异有统计学意义(P＜0.001);假手术与正常对照组相比差异无统计学意义(P=0.058)。
　　 lncRNAs-MRAK134201:方差分析结果表明模型组、假手术组和正常对照组之间差异有统计学意义（F=28.540，P＜0.001）。模型组与正常对照组相比差异有统计学意义(P＜0.001)，模型组与假手术组相比差异有统计学意义(P=0.003);假手术与正常对照组相比差异无统计学意义(P=0.44)。
　　 lncRNAs-MRUC008bux:方差分析结果表明模型组、假手术组和正常对照组之间差异有统计学意义（F=27.560，P=0.01）。模型组与正常对照组差异有统计学意义(P=0.001)，模型组与假手术组相比差异有统计学意义(P=0.001);假手术与正常对照组相比差异无统计学意义(P=0.626)。
　　 lncRNAs-BC168867:方差分析结果表明模型组、假手术组和正常对照组之间差异有统计学意义(F=135.735，P＜0.001)。模型组与正常对照组相比差异有统计学意义(P＜0.001)，模型组与假手术组相比差异有统计学意义（P＜0.001）;假手术与正常对照组相比差异无统计学意义(P=0.718)。
　　 lncRNAs-AY383677:方差分析结果表明模型组、假手术组和正常对照组之间差异有统计学意义(F=16.566，P=0.004)。模型组与正常对照组相比差异有统计学意义(P=0.001≤0.001)，模型组与假手术组相比差异有统计学意义(P=0.007);假手术与正常对照组相比差异无统计学意义(P=0.163)。
　　 lncRNAs-MRAK051903:方差分析结果表明模型组、假手术组和正常对照组之间差异有统计学意义(F=132.180，P＜0.001)。模型组与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.001），模型组与假手术组相比差异有统计学意义(P＜0.001);假手术与正常对照组相比差异无统计学意义(P=0.582)。
　　 lncRNAs-uc318+:方差分析结果表明模型组、假手术组和正常对照组之间差异有统计学意义（F=68.613，P＜0.001）。模型组与正常对照组相比差异有统计学意义(P＜0.001)，模型组与假手术组相比差异有统计学意义(P＜0.001);假手术与正常对照组相比差异无统计学意义(P=0.378)。
　　 lncRNAs-MRAK16399:方差分析结果表明模型组、假手术组和正常对照组之间差异有统计学意义（F=79.616，P＜0.001）模型组与正常对照组相比差异有统计学意义(P＜0.001)，模型组与假手术组相比差异有统计学意义(P＜0.001);假手术与正常对照组相比差异无统计学意义(P=0.47)。
　　 lncRNAs-BC079432:方差分析结果表明模型组、假手术组和正常对照组之间差异有统计学意义（F=71.262，P=0.002）。模型组与正常对照组相比差异有统计学意义(P=0.01)，模型组与假手术组相比差异有统计学意义(P=0.007);假手术与正常对照组相比差异无统计学意义(P=0.914)。
　　 结论:
　　 新一组样本的RT-PCR结果与芯片结果具有很好的一致性，说明实验具有可重复性，芯片结果可靠，芯片提供的大量筛选结果可为后续研究提供指导。各目的基因在假手术组和正常对照组中的表达情况无统计学差异，说明候选lncRNAs与应激反应无关，进一步说明候选lncRNAs是缺血性脑卒中诱导的特异lncRNAs，可对候选的基因进行进一步的功能研究。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 脑缺血模型大鼠大脑皮层长链非编码RNA的表达谱研究

1．1 研究背景

1．2 材料和方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

1．5 小结与结论

参考文献

第二章 生物信息学分析技术挑选研究目的基因

1．1 研究背景

1．2 材料和方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 小结与结论

参考文献

第三章 芯片结果及研究目的基因的RT-PCR验证

1．1 研究背景

1．2 材料和方法

1．3 数据分析与统计

1．4 结果

1．5 讨论

1．6 小结与结论

参考文献

全文总结

综述

缩略语和中英文对照表

攻读博士学位期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明