叶酸受体介导的载顺铂磁性纳米pH敏感靶向给药系统研究

摘要

鼻咽癌是头颈部较常见恶性肿瘤，是我国南方、东南亚及北非等地区最常见的恶性肿瘤之一，其发病率男性高达27.49/万，女性达10.51/万，居所有恶性肿瘤发病率的第三位，死亡率高居第四位。近年来，用顺铂(Cisplatin+氟尿嘧啶(Fluorouracil)方案的诱导化疗及在放疗的同时使用顺铂(Cisplatin)同步化疗已成为局部区域晚期鼻咽癌的标准治疗模式。但尽管采用同期放化疗，目前总的放疗剂量都没有降低，势必引起较大的放疗并发症，包括严重的放射性粘膜炎、局部软组织损伤等，导致患者生活质量较差，对于晚期病例以及放射线不敏感的鼻咽癌病例治疗效果不理想。如何降低化疗药物顺铂的毒性，从而提高晚期鼻咽癌治疗后的生存率和生活质量一直是困扰临床医生的难题。
　　 由于肿瘤具有快速消耗和增殖的病理特点，一般肿瘤组织的微环境是呈酸性，pH大约为6.5，当纳米粒子进入细胞内部后，粒子会遇到pH值更低的溶酶体和内涵体(pH5.0～5.5)，而正常组织的pH为7.4，利用正常组织与病理组织的pH值差异可设计出靶向于肿瘤组织或其他特定器官进行药物传递的pH敏感药物载体，增加药物在病灶部位的浓度，提高生物利用度，这种pH敏感药物载体可用于药物、基因、蛋白质等的控制释放。叶酸受体在肿瘤细胞膜表面高度表达，而在绝大多数正常组织中几乎不表达。利用叶酸和叶酸受体的高度亲和性，在叶酸受体的介导下将与叶酸偶联的药物转运入肿瘤细胞内，在溶酶体和内涵体低pH值酸性环境下药物释放，达到细胞内靶向化疗的目的。我们课题组前期研究发现鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞株HNE-1和喉癌细胞株Hep-2高度表达叶酸受体，并已成功制备了叶酸靶向载顺铂和载基因磁性纳米药物，在鼻咽癌、喉癌基质金属蛋白酶2基因沉默的治疗研究中取得良好效果。但发现药物的靶向性和稳定性尚不满意，本课题拟在原研究基础上，根据肿瘤微环境的酸性特征，引入pH敏感细胞内释放药物等新的研究成果，设计、筛选、构建出一个新型的具有分子靶向、磁靶向、通过肿瘤酸性微环境完成PH敏感定向释药、在外置交变磁场的作用下同时具有热疗和放疗增敏作用的智能靶向给药系统。采用透射电镜、振动样品磁强计(VSM)、激光动态粒径仪、紫外分光光度计等对其理化性状等进行表征，同时以叶酸受体表达阳性鼻咽癌细胞株HNE-1作为实验模型，通过药物摄取和体外抑制及凋亡实验评价这种新型的叶酸修饰的载顺铂磁性纳米pH敏感靶向药物的靶向性和治疗效果，为开发新的智能抗癌药物奠定基础。共分三章:
　　 第一章，采用免疫组织化学法检测
　　 30例鼻咽癌组织标本中叶酸受体(FRα)的表达，同时采用Western-Blot和RT-PCR的方法进一步检测鼻咽癌组织中FRα在蛋白质和mRNA水平的表达，筛选肿瘤靶分子。免疫组化结果显示鼻咽癌组织FRα表达阳性率达为86.7％，临床分期晚的病例阳性率较临床分期早的病人更高。Western-Blot和RT-PCR结果也表明鼻咽癌组织FRα高度表达。这些结果提示将FRα作为治疗鼻咽癌的靶点具有高度的可行性。
　　 第二章，叶酸修饰的载顺铂磁性纳米pH敏感靶向药物的制备和表征。
　　 采用化学共沉淀法制备醛基化海藻酸钠改性的四氧化三铁纳米粒(MNPs)，海藻酸钠表面的羧基通过配位络合作用与顺铂连接，制备偶联叶酸的双肼基PEG，其肼基端与海藻酸钠的醛基通过腙键连接包裹载药纳米粒，经纯化获得叶酸修饰的载顺铂磁性纳米pH敏感靶向抗癌药物(FA-PEG-NH-N=MNPs-CDDP)。表征结果显示:透射电镜下该磁性纳米pH敏感靶向药物的磁核平均粒径约为10.2±1.5nm，激光粒度仪测得平均水动力学直径176.6±1.1nm，zeta电位为-20.91±1.76 mv，顺铂含量为0.773mg/ml，铁含量约为1.908mg/ml，最大饱和磁化强度为16.3±0.2emu/g，具有良好的稳定性和磁响应性，在pH值低于6.5的酸性条件下释放药物，具有pH敏感性。
　　 第三章，叶酸修饰的载顺铂磁性纳米pH敏感靶向药物对鼻咽癌细胞的靶向性实验研究。
　　 以叶酸受体阳性HNE-1细胞作研究对象，叶酸受体阴性鼻咽癌细胞CNE-2作对照，通过细胞摄取铁染色、透射电镜观察叶酸修饰的载顺铂磁性纳米pH敏感靶向药物(FA-PEG-NH-N=MNPs-CDDP)的靶向性。采用MTS法、流式细胞分析、TUNNEL实验和透射电镜方法检测FA-PEG-NH-N=MNPs-CDDP对鼻咽癌细胞HNE-1的体外抑制效应和细胞凋亡。结果显示:FA-PEG-NH-N=MNPs-CDDP易被叶酸受体阳性鼻咽癌细胞HNE-I摄取，而不易被叶酸受体阴性的CHE-2摄取，纳米药物被细胞摄取后存在于细胞浆中，提示该纳米药物具有良好的分子靶向性。MTS结果显示:FA-PEG-NH-N=MNPs-CDDP(7.4)、FA-PEG-NH-N=MNPs-CDDP(6.5)和CDDP三者对HNE-1的抑制率均存在明显的剂量依赖性和时间依赖性，而MNPs对HNE-1的生长无影响。FA-PEG-NH-N=MNPs-CDDP(6.5)对细胞的抑制大于PH=7.4组，提示药物在低pH值6.5时有释放。流式细胞、Tunel法检测结果与MTT一致，FA-PEG-NH-N=MNPs-CDDP实验组(pH6.5)、实验组(pH7.4)和CDDP分别与HNE-1细胞共培养48小时后，细胞均发生明显凋亡，且凋亡率随药物浓度增加而升高。低浓度时均导致细胞G2/M期阻滞，高浓度时引起S期阻滞。透射电镜结果表明摄取FA-PEG-NH-N=MNPs-CDDP的细胞出现明显凋亡形态改变，而摄取MNPs的细胞形态无改变。
　　 以上结果显示叶酸受体在鼻咽癌组织不同水平均高度表达，适合作为药物分子靶点，叶酸修饰的载顺铂磁性纳米pH敏感靶向药物能被HNE-1细胞摄取，对其生长的体外抑制效应与单纯顺铂相同，FA-PEG-NH-N=MNPs-CDDP实验组(pH6.5)、实验组(pH7.4)具有缓释作用，而实验组(pH6.5)则具有pH敏感释放药物特性，并通过阻滞细胞周期诱导细胞凋亡，而载体本身无细胞毒性。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 叶酸受体在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

1 材料

2 实验方法

3．结果

4 讨论

5．结论

参考文献

第二章 叶酸受体介导的载顺铂磁性纳米pH敏感药物的制备及表征

1．材料

2 实验方法

3 载体药物的理化性质表征

4．统计学分析

5．结果

6 讨论

7 结论

参考文献

第三章 叶酸介导的载顺铂磁性纳米pH敏感靶向药物的体外实验研究

1．材料

2 实验方法

3．结果

4．讨论

5．结论

参考文献

全文总结

攻读学位期间成果

致谢

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