骨髓间充质干细胞移植联合雌激素治疗宫腔粘连的实验研究

摘要

研究背景:
　　 宫腔粘连(intrauterine adhesions，IUA)又称Asherman综合征，1894年由Fritsch最先描述，1948年Asherman首次详细报道，将其定义为:由于子宫内膜损伤导致子宫内膜纤维化，宫腔部分或全部闭塞，继而引起月经过少、闭经、不孕或反复流产。在继发性闭经患者中IUA发病率占5.1％，女性不孕症中IUA发病率占4.8％，而流产后刮宫的IUA发病率高达37.6％。近年来由于频繁的宫腔操作及宫腔镜手术的普及，IUA的发病率和检出率逐渐上升，而且发病年龄呈年轻化趋势，已成为女性继发不孕的第二大病因。尽管临床医生不断寻求新的治疗方案，IUA的治愈率和妊娠率仍无明显改善，且复发率较高（轻度IUA患者治疗后复发率为33.3％，重度IUA患者治疗后复发率更是高达66.7％），由此引起的不孕以及反复流产、早产、前置胎盘、胎盘粘连或植入等产科并发症严重威胁着女性的生殖健康。
　　 IUA的防治多年来一直困扰着临床医生，其高发病率及其所导致的女性生育功能损害已成为临床上亟待解决的问题。目前临床上针对IUA的治疗旨在恢复宫腔形态，防止粘连复发，促进损伤子宫内膜修复再生，恢复正常生育功能。治疗IUA的3个重要步骤是宫腔镜下宫腔粘连分离术、术中放置宫内节育器以及术后应用雌孕激素，但存在着治疗周期长、治愈率低下、粘连易复发、妊娠率低、大剂量雌激素应用增加患者乳腺和子宫内膜肿瘤风险等问题，而且严重的肌性或结缔组织性IUA中子宫内膜基底层已被破坏，对雌孕激素反应较差。
　　 迄今为止，国内外学者对IUA的发病机制进行了大量研究，一致认为子宫内膜修复障碍可能是IUA形成的主要机制。如流产后刮宫或其它宫腔操作后，由于一些病理因素，使子宫内膜修复发生障碍，结果导致瘢痕形成、粘连发生。近年来，国内外学者相继用不同研究方法证实了子宫内膜干细胞的存在，为与子宫内膜增生或修复异常相关的各种妇科疾病发病机制提供了新见解，如:子宫内膜癌和子宫内膜异位症等，可能与子宫内膜干细胞的异常分化和增殖有关;而不明原因的子宫内膜薄和宫腔粘连可能与子宫内膜干细胞的减少或缺失有关。
　　 骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，是目前组织工程中理想的干细胞来源。BMSCs因具有自我更新、多潜能分化、取材方便、能够自体移植避免免疫排斥和伦理问题等特点，已引起了广泛的关注，尤其是在修复损伤组织方面。移植BMSCs可用于治疗多种损伤性疾病，如心肌梗塞、扩张性心肌病造成的心肌损伤;修复急性肾损伤引起的内皮细胞和肾小管细胞，改善肾功能;亦可修复骨、软骨和肌腱缺损。但BMSCs在IUA所致的子宫内膜损伤中的治疗潜能未见相关报道，如果BMSCs能成功应用于IUA的治疗，修复损伤的子宫内膜，必将为IUA的治疗开辟新的领域。
　　 因此，本研究在建立BMSCs体外分离、培养、扩增体系的基础上，对BMSCs进行荧光标记。检测BMSCs在体外一定培养条件下向子宫内膜上皮细胞和/或间质细胞分化的能力及其可能的机制。进一步建立新西兰大白兔宫腔粘连动物模型，将体外扩增的兔BMSCs，标记后直接注射至双侧子宫肌壁间，观察BMSCs在子宫组织的存活和迁移，观察移植后子宫内膜形态学的变化，检测子宫组织和子宫内膜腺上皮特异性标记物基因水平和蛋白表达的改变。初步研究骨髓间充质干细胞移植和雌激素治疗在修复子宫内膜损伤中可能的作用及机制，为探索新的宫腔粘连的治疗方向提供理论依据。
　　 第一章新西兰大白兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定及标记
　　 目的:
　　 建立幼年雌性新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外分离，培养方法，研究其生物学特性和表型特征;用荧光染料对BMSCs进行标记，并观察其对细胞形态，凋亡和增殖活性等生物学特征的影响。
　　 方法:
　　 1.在无菌条件下取出兔股骨和胫骨，采用全骨髓贴壁细胞分离法分离纯化兔骨髓间充质干细胞，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基培养BMSCs。待细胞铺满瓶底的80％以上，按照1∶2～1∶3传代培养。
　　 2.采用流式细胞仪检测细胞表面CD44、CD45和CD90的表达，进行鉴定。
　　 3.采用PKH26对BMSCs进行荧光标记，检测即时标记率，通过Annexin-Ⅴ法检测凋亡率、CCK-8法检测BMSCs的增殖能力，绘制生长曲线，以明确PKH26标记对体外培养BMSCs生物学特性的影响;通过流式细胞仪检测PKH26标记对兔BMSCs表面CD44、CD45和CD90表达的影响。
　　 结果:
　　 1.体外原代培养的BMSCs接种24h后部分贴壁，呈短小梭形或多角形;72h后绝大部分细胞贴壁，呈纺锤形或梭形，有散在分布的细胞集落形成;9～10d后可进行首次传代。传3代以后，细胞形态趋于一致，呈纤维细胞样贴壁生长。
　　 2.第3代BMSCs95％以上的细胞表达CD44和CD90，不表达CD45，证实所培养的细胞为间充质干细胞。
　　 3.PKH26荧光染色的新西兰大白兔BMSCs即时标记率为100％，标记的细胞培养24h后，其形态与未标记的BMSCs相比无明显改变。PKH26标记对兔骨髓间充质干细胞的增殖能力、凋亡率和细胞表面标志的表达均无影响。
　　 结论:
　　 1.应用全骨髓贴壁细胞分离法可以获得纯度较高、活性较好、表型稳定均一的骨髓间充质干细胞。
　　 2.纯化的兔骨髓间充质干细胞表达CD44和CD90，不表达CD45，可用于进一步的体外诱导分化和体内细胞移植研究。
　　 3.PKH26标记BMSCs方法简单，标记率高，可标记大量细胞，且不影响BMSCs生物学特性，是追踪BMSCs在体内迁移，定植和分化的有效方法。
　　 第二章兔骨髓间充质干细胞向子宫内膜细胞方向分化的体外实验研究
　　 目的:
　　 探讨BMSCs在特定培养条件下向子宫内膜细胞分化的能力及其可能的调控机制。
　　 方法:
　　 1.制备子宫内膜条件培养液(ECM)。
　　 2.实验分组:①对照组:完全培养基;②ECM组:含20％ECM的完全培养基;③ECM+E-8组:含20％ECM和10-8mol/L17β-E2的完全培养基;④ECM+E-7组:含20％ECM和10-7mol/L17β-E2的完全培养基;⑤ECM+E-6组:含20％ECM和10-6mol/L17β-E2的完全培养基;⑥ECM+E-5组:含20％ECM和10-5mol/L17β-E2的完全培养基。
　　 3.抽提培养5天后细胞的mRNA，采用荧光定量PCR(FQ-PCR)方法检测分化细胞的CK18、ESR1和VIM基因水平。
　　 4.提取培养5天后细胞的蛋白，采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)法检测分化细胞的CK、VIM和ESR1蛋白含量;
　　 5.采用免疫荧光(IF)方法检测培养5天后细胞表面上皮细胞标记物CK蛋白的表达。
　　 结果:
　　 1.mRNA表达检测结果显示如下:
　　 (1)各组CK18 mRNA相对表达量由高到低依次为ECM(7.64)、ECM+E-6(6.15)、ECM+E-7(5.62)、ECM+E-8(4.70)、ECM+E-5(1.49)和对照组(1.00)。各实验组与对照组相比，ECM+E-5组无显著性差异，其余四组均有显著性差异（PECM=0.000，PE-8=0.000，PE-7=0.000，PE-6=0.000，PE-5=0.168）。五个实验组之间，ECM组分别与ECM+E-8(P=0.000)、ECM+E-7(P=0.000)、ECM+E-6（P=0.001）和ECM+E-5组(P=0.000)相比均有显著性差异。CK18基因表达和17β-雌二醇浓度呈显著负相关(rs=-0.615，P=0.000)。
　　 (2)各组ESR1 mRNA相对表达量由高到低依次为ECM(1.45)、ECM+E-6(1.38)、ECM+E-8(1.37)、ECM+E-7(1.36)、对照组(1.00)和ECM+E-5(0.73)。各实验组与对照组相比均有显著性差异（P值均为0.000）。五个实验组之间，ECM组分别与ECM+E-8(P=0.016)、ECM+E-7(P=0.006)、ECM+E-6（P=0.020）和ECM+E-5组(P=0.000)相比均有显著性差异。ESR1相对表达量和17β-雌二醇浓度呈显著负相关（rs=-0.729，P=0.000）。
　　 (3)各组VIM mRNA相对表达量均数由高到低依次为ECM(8.22)、ECM+E-5(7.29)、ECM+E-7(6.15)、ECM+E-8(4.67)、ECM+E-6(2.33)和对照组(1.00)。各实验组与对照组相比均有显著性差异（P值均为0.000）。五个实验组之间，ECM组分别与ECM+E-8(P=0.000)、ECM+E-7(P=0.000)、ECM+E-6(P=0.000)和ECM+E-5组（P=0.000）相比均有显著性差异。VIM基因水平和17β-雌二醇浓度呈显著正相关（rs=0.611，P=0.000）。
　　 2.蛋白定量分析结果显示如下:
　　 (1)各组CK蛋白相对表达量均数由高到低依次为ECM+E-5(0.92)、ECM+E-6(0.90)、ECM+E-7(0.88)、ECM(0.84)、ECM+E-8(0.58)和对照组(0.27)。各实验组与对照组相比均有显著性差异（P值均为0.000）。五个实验组之间，ECM组分别与ECM+E-8(P=0.000)、ECM+E-7（P=0.016）、ECM+E-6（P=0.004）和ECM+E-5组(P=0.001)相比均有显著性差异。CK蛋白相对表达量和17β-E2浓度呈显著正相关（rs=0.725，P=0.000）。
　　 (2)各组ESR1蛋白相对表达量均数由高到低依次为ECM(0.75)、ECM+E-7(0.73)、ECM+E-5(0.35)、对照组(0.17)、ECM+E-8(0.14)和ECM+E-6(0.11)。各实验组与对照组相比，ECM+E-8组无显著性差异，其余四组均有显著性差异(PECM=0.000，PE-8=0.101，PE-7=0.000，PE-6=0.002，PE-5=0.000)。五个实验组之间，ECM组分别与ECM+E-8（P=0.001）、ECM+E-6（P=0.000）和ECM+E-5组（P=0.000）相比均有显著性差异，和ECM+E-7(P=0.126)相比无显著性差异。ESR1蛋白表达量和17β-雌二醇浓度无相关关系(rs=0.017，P=0.929)。
　　 (3)各组VIM蛋白相对表达量均数由高到低依次为ECM+E-6(0.96)、ECM(0.92)、ECM+E-5(0.91)、ECM+E-8(0.85)、ECM+E-7(0.77)和对照组(0.14)。各实验组与对照组相比均有显著性差异（P值均为0.000）。五个实验组之间，ECM组分别与ECM+E-8(P=0.001)、ECM+E-7(P=0.000)和ECM+E-6(P=0.011)相比均有显著性差异，和ECM+E-5组(P=0.517)相比无显著性差异。VIM蛋白表达量和17β-雌二醇浓度呈正相关关系（rs=0.382，P=0.037）。
　　 3.CK蛋白荧光结果显示:细胞核为蓝色荧光，CK蛋白阳性细胞胞浆为绿色荧光。对照组BMSCs细胞CK荧光染色阴性，各实验均可见CK阳性细胞。
　　 结论:
　　 1.子宫内膜条件培养基和17β-雌二醇可以诱导兔骨髓间充质干细胞向子宫内膜细胞方向分化，分化后的细胞CK18、VIM、和ESR1 mRNA水平增加，同时CK、VIM和ESR1蛋白表达也增加，说明骨髓间充质干细胞同时向子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞方向分化。
　　 2.子宫内膜条件培养基模拟的子宫内膜微环境是诱导兔骨髓间充质干细胞向子宫内膜腺上皮和间质细胞分化的关键因素，而171β-雌二醇则能够适当调控这种分化效应。
　　 第三章构建成年雌性新西兰大白兔宫腔粘连动物模型的实验研究
　　 目的:
　　 根据IUA最主要的2个病因——创伤和感染，分别采用机械损伤、感染损伤以及机械和感染双重损伤的方法，拟探索建立新西兰大白兔IUA动物模型的最佳方案。通过这个动物模型，为后续研究体内移植BMSCs和应用雌激素是否能治疗IUA及其可能机制提供一个平台。
　　 方法:
　　 1.采用12周龄雌性新西兰大白兔建立宫腔粘连动物模型。建模前1天用10号医用无菌手术线制备脂多糖(LPS)手术棉线。
　　 2.大白兔随机分为4组，每组16只:①对照组;②机械损伤组:用子宫内膜刮勺搔刮中上段子宫腔;③感染损伤组:宫腔留置LPS手术棉线48h;④双重损伤组（机械+感染损伤）:子宫内膜刮勺搔刮中上段子宫腔后，宫腔留置LPS手术棉线48h。每组分别于建模后0h，24h，48h，72h和14d，28d处死2只大白兔（4个子宫），建模后7d处死4只大白兔（8个子宫），收集子宫组织。
　　 3.采用HE染色观察子宫内膜形态学改变，计数建模一周后子宫内膜腺体数目。
　　 4.采用Masson染色观察子宫内膜纤维化情况，用图像分析软件分析建模一周后子宫内膜纤维化面积比。
　　 结果:
　　 1.建模后子宫内膜形态学改变:三种方法建模后0h，子宫内膜均出现表面上皮脱落，子宫内膜间质裸露或变薄;间质出血，中性粒细胞浸润;毛细血管破裂、出血。建模后24～72 h，机械损伤组和感染损伤组子宫内膜腺上皮均有不同程度再生，并可见新生腺体，间质充血水肿逐渐减轻;双重损伤组偶有扁平上皮细胞再生，而无腺体再生，间质纤维化增生。建模后7d，机械损伤组和感染损伤组子宫内膜腺上皮基本恢复，上皮下出现腺体，间质仍可见充血、水肿，淋巴细胞浸润;双重损伤组则可见宫腔粘连带形成，腺体稀疏，间质纤维化增生。
　　 2.建模后7d各组纤维化面积比分别为:对照组（27.50±3.34）、机械损伤组（40.52±3.72）、感染损伤组（37.80±3.79）和双重损伤组（68.03±4.10）。各实验组与对照组相比，感染损伤组无显著性差异，其余两组均有显著性差异（P机械=0.020，P感染=0.062，P双重=0.000）。三种建模方法之间，双重损伤组分别与机械损伤组组(P=0.000)和感染损伤组(P=0.000)相比均有显著性差异。
　　 3.建模后7d腺体计数分别为:对照组（14.97±0.59）、机械损伤组（12.66±0.52）、感染损伤组（13.59±0.55）和双重损伤组（4.19±0.48）。各实验组与对照组相比，感染损伤组无显著性差异，其余两组均有显著性差异（P机械=0.005，P感染=0.081，P双重=0.000）。三种建模方法之间，双重损伤组分别与机械损伤组（P=0.000）和感染损伤组(P=0.000)相比均有显著性差异。
　　 4.机械损伤、感染损伤和双重损伤的建模成功率分别为75％、62.5％和100％，三种方法的建模成功率有显著差异，根据平均秩次进一步推断，双重损伤法成功率最高，机械损伤法次之，感染损伤法最差（x2=11.000，P=0.012）。
　　 结论:
　　 双重损伤法能引起兔子宫内膜不可逆的损伤，形成瘢痕修复及纤维化粘连带，并且建模成功率高，是一种稳定而有效的建立新西兰大白兔IUA动物模型的方法。
　　 第四章骨髓间充质干细胞移植联合雌激素修复子宫内膜损伤的体内实验研究
　　 目的:
　　 在前期建立宫腔粘连动物模型基础上，给予兔的双侧子宫移植BMSCs以及雌激素治疗，探讨其疗效及机制，以期寻求IUA新的治疗方法。
　　 方法:
　　 1.采用60只12周龄雌性新西兰大白兔分为5组，每组各12只。①对照组;②模型组;③移植组;④雌激素组;⑤联合治疗组，即BMSCs移植+雌激素治疗组。
　　 2.采用双重损伤法构建动物模型。移植细胞为PKH26标记的第2代BMSCs。每组分别于治疗前(建模后1 w)，治疗后1w、2w和4w时各处死3只大白兔（6个子宫），分别收集双侧子宫组织，同时收集耳缘静脉血2ml。
　　 3.采取的兔耳缘静脉血离心后留取血清用ELISA法检测血清雌二醇。
　　 4.将收集的子宫组织分成4部分检测:
　　 (1) HE染色和Masson染色观察子宫内膜形态学变化、腺体计数和纤维化面积比。
　　 (2)荧光显微镜观察移植BMSCs在兔子宫、卵巢、宫颈和阴道中的定位。
　　 (3)提取子宫组织RNA，采用FQ-PCR法检测CK18，VIM，ESR1和TFG-B1基因水平。
　　 (4)提取子宫组织蛋白，采用Western blot方法检测CK和ESR1蛋白表达量。
　　 (5)采用IHC方法检测子宫内膜组织中CK，VIM，ESR1和TFG-β1蛋白表达。
　　 结果:
　　 1.HE染色结果显示:雌激素组，移植组和联合治疗组从治疗后1w开始，子宫内膜腺体数量均有不同程度的增加，新生腺体呈圆形或椭圆形。
　　 (1)治疗前，各实验组与对照组相比，均有显著性差异（P值均为0.000）。联合治疗组分别与移植组（P=0.159）和雌激素组（P=0.556）相比均无显著性差异。
　　 (2)治疗后1 w，各实验组与对照组相比均有显著性差异(P模型=0.000，P移植=0.001，P雌激素=0.001，P联合=0.002)。联合治疗组分别与移植组（P=0.482）和雌激素组（P=0.723）相比均无显著性差异。
　　 (3)治疗后2w，各实验组与对照组相比，联合治疗组无显著性差异，其余三组均有显著性差异（P模型=0.000，P移植=0.005，P雌激素=0.003，P联合=0.124）。联合治疗组和移植组(P=0.079)相比无显著性差异，和雌激素组（P=0.049）相比有显著性差异。
　　 (4)治疗后4w，各实验组与对照组相比，移植组和雌激素组无显著性差异，其余两组均有显著性差异（P模型=0.002，P移植=0.411，P雌激素=0.146，P联合=0.028）。联合治疗组分别与移植组（P=0.006）和雌激素组(P=0.002)相比均有显著性差异。
　　 2.Masson染色结果显示:各治疗组子宫内膜间质蓝染的胶原纤维不同程度的减少，模型组在治疗前后子宫内膜间质蓝染的胶原纤维基本没有减少。
　　 (1)治疗前，各实验组纤维化面积比与对照组相比均有显著性差异（P模型=0.002，P移植=0.002，P雌激素=0.002，P联合=0.004）。联合治疗组分别与移植组（P=0.629）和雌激素组(P=0.668)相比均无显著性差异。
　　 (2)治疗后1w，各实验组与对照组相比，联合治疗组无显著性差异，其余三组均有显著性差异（P模型=0.000，P移植=0.014，P雌激素=0.013，P联合=0.138）。联合治疗组分别与移植组（P=0.205）和雌激素组(P=0.191)相比均无显著性差异。
　　 (3)治疗后2w，各实验组与对照组相比，移植组和联合治疗组无显著性差异，其余两组均有显著性差异(P模型=0.000，P移植=0.918，P雌激素=0.002，P联合=0.792)。联合治疗组和移植组(P=0.714)相比无显著性差异，和雌激素组(P=0.001)相比有显著性差异。
　　 (4)治疗后4w，各实验组与对照组相比，模型组有显著性差异，其余三组均无显著性差异(P模型=0.000，P移植=0.342，P雌激素=0.980，P联合=0.670)。联合治疗组分别与移植组(P=0.589)和雌激素组(P=0.688)相比均无显著性差异。
　　 3.荧光显微镜下观察显示:移植后7d， BMSCs移植组和联合治疗组可见到少量红色荧光，持续至移植后21d，而其余各组以及相同时间点的宫颈、阴道和卵巢组织均不能见到红色荧光表达。与DAPI染核的蓝色荧光视野对比观察，红色荧光主要分布在子宫内膜腺上皮细胞附近，子宫肌层内见不到红色荧光。
　　 4.血清雌二醇浓度分析显示:
　　 (1)治疗前各实验组和对照组血清雌二醇浓度无显著差异（F=0.023，P=0.999），说明损伤子宫内膜过程中未影响卵巢功能。
　　 (2)治疗后1w，各实验组与对照组相比，雌激素组和联合治疗组有显著性差异，其余两组均无显著性差异(P模型=0.943，P移植=0.960，P雌激素=0.000，P联合=0.000)。联合治疗组和移植组（P=0.000）相比有显著性差异，和雌激素组(P=0.224)相比无显著性差异。
　　 (3)治疗后2w，各实验组与对照组相比，雌激素组和联合治疗组有显著性差异，其余两组均无显著性差异(P模型=0.599，P移植=0.932，P雌激素=0.000，P联合=0.000)。联合治疗组和移植组（P=0.000）相比有显著性差异，和雌激素组（P=0.939）相比无显著性差异。
　　 (4)治疗后4w，各实验组与对照组相比，联合治疗组有显著性差异，其余三组均无显著性差异（P模型=0.802，P移植=0.635，P雌激素=0.094，P联合=0.001）。联合治疗组分别与移植组(P=0.041）和雌激素组（P=0.010）相比均有显著性差异。
　　 5.mRNA表达水平分析结果显示如下:
　　 (1)各组不同时间点子宫组织CK18 mRNA相对表达量分析结果显示:
　　 ①治疗前，各实验组CK18 mRNA相对表达量与对照组相比均有显著性差异（P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P联合=0.000）。联合治疗组分别与移植组（P=0.835）和雌激素组（P=0.776）相比均无显著性差异。
　　 ②治疗后1w，各实验组与对照组相比，模型组和移植组均有显著性差异，其余两组无显著性差异（P模型=0.002，P移植=0.000，P雌激素=0.377，P联合=0.434）。联合治疗组和移植组（P=0.000）相比有显著性差异，和雌激素组（P=0.915）相比无显著性差异。
　　 ③治疗后2 w，各实验组与对照组相比，移植组有显著性差异，其余三组均无显著性差异（P模型=0.197，P移植=0.008，P雌激素=0.062，P联合=0.119）。联合治疗组分别与移植组（P=0.180）和雌激素组（P=0.101）相比均无显著性差异。
　　 ④治疗后4 w，各实验组与对照组相比，模型组和联合治疗组有显著性差异，其余两组均无显著性差异(P模型=0.027，P移植=0.110，P雌激素=0.110，P联合=0.007)。联合治疗组分别与移植组（P=0.252）和雌激素组(P=0.351)相比均无显著性差异。
　　 (2)各组不同时间点子宫组织VIM mRNA相对表达量分析结果显示:
　　 ①治疗前，各实验组VIM mRNA相对表达量与对照组相比均有显著性差异(P模型=0.026，P移植=0.008，P雌激素=0.024，P联合=0.010)。联合治疗组分别与移植组（P=0.868）和雌激素组(P=0.630)相比均无显著性差异。
　　 ②治疗后1w，各实验组与对照组相比，模型组和联合治疗组均有显著性差异，其余两组均无显著性差异（P模型=0.039，P移植=0.100，P雌激素=0.101，P联合=0.021）。联合治疗组和移植组（P=0.764）相比无显著性差异，和雌激素组（P=0.038）相比有显著性差异。
　　 ③治疗后2w，各实验组与对照组相比，模型组和移植组均有显著性差异，其余两组均无显著性差异(P模型=0.006，P移植=0.042，P雌激素=0.079，P联合=0.199)。联合治疗组分别与移植组（P=0.116）和雌激素组（P=0.095）相比均无显著性差异。
　　 ④治疗后4 w，各实验组与对照组相比，联合治疗组有显著性差异，其余三组均无显著性差异（P模型=1.000，P移植=0.136，P雌激素=0.057，P联合=0.042。联合治疗组分别与移植组（P=0.151）和雌激素组（P=0.090）相比均无显著性差异。
　　 (3)各组不同时间点子宫组织ESR1 mRNA相对表达量分析结果显示:
　　 ①治疗前，各实验组ESR1mRNA相对表达量与对照组相比均有显著性差异（P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P联合=0.010）。联合治疗组分别与移植组(P=0.340)和雌激素组（P=0.835）相比均无显著性差异。
　　 ②治疗后1w，各实验组与对照组相比，移植组和联合治疗组有显著性差异，其余两组均无显著性差异(P模型=0.993，P移植=0.014，P雌激素=0.214，P联合=0.024)。联合治疗组分别与移植组（P=0.023）和雌激素组（P=0.025）相比均有显著性差异。
　　 ③治疗后2w，各实验组与对照组相比，联合治疗组有显著性差异，其余三组均无显著性差异（P模型=0.971，P移植=1.000，P雌激素=0.078，P联合=0.019）。联合治疗组分别与移植组（P=0.124）和雌激素组（P=0.251）相比均无显著性差异。
　　 ④治疗后4w，各实验组与对照组相比，联合治疗组有显著性差异，其余三组均无显著性差异（P模型=0.888，P移植=0.544，P雌激素=0.112，P联合=0.002）。联合治疗组分别与移植组（P=0.136）和雌激素组（P=0.463）相比均无显著性差异。
　　 (4)各组不同时间点子宫组织TGF-B1 mRNA相对表达量分析结果显示:
　　 ①治疗前，各实验组TGF-B1 mRNA相对表达量与对照组相比均有显著性差异（P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P联合=0.000）。联合治疗组分别与移植组（P=0.467）和雌激素组（P=0.987）相比均无显著性差异。
　　 ②治疗后1w，各实验组与对照组相比，雌激素组无显著性差异，其余三组均有显著性差异（P模型=0.009，P移植=0.032，P雌激素=0.132，P联合=0.014）。联合治疗组分别与移植组（P=0.014）和雌激素组（P=0.013）相比均有显著性差异。
　　 ③治疗后2w，各实验组与对照组相比，移植组无显著性差异，其余三组均有显著性差异（P模型=0.006，P移植=0.079，P雌激素=0.001，P联合=0.000）。联合治疗组和移植组（P=0.009）相比有显著性差异，和雌激素组（P=0.936）相比无显著性差异。
　　 ④治疗后4w，各实验组与对照组相比，雌激素组和联合治疗组均有显著性差异，其余两组无显著性差异（P模型=0.214，P移植=0.830，P雌激素=0.000，P联合=0.000）。联合治疗组和移植组（P=0.042）相比有显著性差异，和雌激素组（P=0.058）相比无显著性差异。
　　 6.子宫组织蛋白定量检测结果分析显示:
　　 (1)各组不同时间点子宫组织CK蛋白相对表达量分析结果显示:
　　 ①治疗前，各实验组子宫组织CK蛋白相对表达量与对照组相比均有显著性差异（P值均为0.000）。联合治疗组分别与移植组（P=0.755）和雌激素组(P=0.646)相比均无显著性差异。
　　 ②治疗后1w，各实验组与对照组相比均有显著性差异（P值均为0.000）。联合治疗组分别与移植组(P=0.851)和雌激素组（P=0.329）相比均无显著性差异。
　　 ③治疗后2w，各实验组与对照组相比均有显著性差异（P值均为0.000）。联合治疗组分别与移植组(P=0.002)和雌激素组（P=0.002）相比均有显著性差异。
　　 ④治疗后4w，各实验组与对照组相比均有显著性差异（P值均为0.000）。联合治疗组和移植组（P=0.300）相比无显著性差异，和雌激素组（P=0.001）相比有显著性差异。
　　 (2)各组不同时间点子宫组织ESR1蛋白相对表达量分析结果显示:
　　 ①治疗前，各实验组子宫组织ESR1蛋白相对表达量与对照组相比均有显著性差异（P值均为0.000）。三个治疗组之间，联合治疗组分别与移植组(P=0.616)和雌激素组(P=0.350)相比均无显著性差异。
　　 ②治疗后1w，各实验组与对照组相比均有显著性差异（P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P联合=0.002）。三个治疗组之间，联合治疗组分别与移植组(P=0.000)和雌激素组(P=0.000)相比均有显著性差异。
　　 ③治疗后2w，各实验组与对照组相比均有显著性差异（P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P联合=0.043）。联合治疗组分别与移植组（P=0.000）和雌激素组(P=0.000)相比均有显著性差异。
　　 ④治疗后4w，各实验组与对照组相比，联合治疗组无显著性差异，其余三组均有显著性差异(P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P联合=0.248)。联合治疗组分别与移植组(P=0.000)和雌激素组(P=0.000)相比均有显著性差异。
　　 7.IHC检测结果显示:
　　 (1)CK蛋白在子宫内膜腺上皮的阳性着色为细胞膜呈棕黄色或棕褐色。
　　 ①治疗前，整体比较各组无显著性差异（F=0.443，P=0.775）。
　　 ②治疗后1w，各实验组与对照组相比，雌激素组有显著性差异，其余三组均无显著性差异（P模型=0.990，P移植=0.941，P雌激素=0.050，P联合=0.819）。联合治疗组分别与移植组(P=0.961)和雌激素组（P=0.108）相比无显著性差异。
　　 ③治疗后2w，各实验组与对照组相比，移植组和雌激素组有显著性差异，其余两组均无显著性差异（P模型=0.566，P移植=0.022，P雌激素=0.026，P联合=0.397）。三个治疗组之间，联合治疗组分别与移植组（P=0.098）和雌激素组（P=0.114）相比均无显著性差异。
　　 ④治疗后4w，各实验组与对照组相比均无显著性差异（P模型=0.635，P移植=0.325，P雌激素=0.696，P联合=0.999）。联合治疗组和移植组（P=0.020）相比有显著性差异，和雌激素组（P=0.080）相比无显著性差异。
　　 (2) VIM蛋白在正常子宫内膜腺上皮细胞几乎不着色，或细胞膜着色，呈棕黄色;在其余4组的腺上皮阳性着色为细胞膜或细胞浆呈棕黄色或棕褐色。
　　 ①治疗前，各实验组与对照组相比，雌激素组和联合治疗组有显著性差异，其余两组均无显著性差异（P模型=0.093，P移植=0.124，P雌激素=0.024，P联合=0.030）。联合治疗组分别与移植组（P=1.000）和雌激素组(P=1.000)相比无显著性差异。
　　 ②治疗后1w，各实验组与对照组相比，模型组和移植组有显著性差异，其余两组均无显著性差异（P模型=0.048，P移植=0.001，P雌激素=0.998，P联合=0.321）。联合治疗组和移植组（P=0.012）相比有显著性差异，和雌激素组（P=0.298）相比无显著性差异。
　　 ③治疗后2w，各实验组与对照组相比均无显著性差异（P模型=0.232，P移植=0.563，P雌激素=0.072，P联合=0.545）。联合治疗组分别与移植组（P=0.975）和雌激素组（P=0.063）相比均无显著性差异。
　　 ④治疗后4w，各实验组与对照组相比，模型组有显著性差异，其余三组均无显著性差异（P模型=0.038，P移植=0.931，P雌激素=0.717，P联合=0.988）。联合治疗组分别与移植组（P=0.724）和雌激素组（P=0.698）相比均无显著性差异。
　　 (3) ESR1蛋白在正常子宫内膜腺上皮细胞核着色，呈棕黄色或黄褐色;在其余4组的腺上皮阳性着色为细胞核或细胞浆呈棕黄色或棕褐色，阴性为在腺上皮细胞不着色。
　　 ①治疗前，各实验组与对照组相比均有显著性差异（P模型=0.000，P移植=0.000，P雌激素=0.000，P联合=0.000）。联合治疗组分别与移植组（P=0.224）和雌激素组（P=0.932）相比均无显著性差异。
　　 ②治疗后1w，各实验组与对照组相比，模型组有显著性差异，其余三组均无显著性差异（P模型=0.037，P移植=0.597，P雌激素=0.851，P联合=0.659）。三个治疗组之间，联合治疗组分别与移植组（P=0.992）和雌激素组(P=0.307)相比均无显著性差异。
　　 ③治疗后2w，各实验组与对照组相比均有显著性差异（P模型=0.000，P移植=0.003，P雌激素=0.001，P联合=0.050）。联合治疗组分别与移植组（P=0.115）和雌激素组（P=0.060）相比均无显著性差异。
　　 ④治疗后4w，各实验组与对照组相比，模型组和雌激素组有显著性差异，其余两组均无显著性差异（P模型=0.002，P移植=0.535，P雌激素=0.007，P联合=0.488）。联合治疗组和移植组（P=0.203）相比无显著性差异，和雌激素组（P=0.002）相比有显著性差异。
　　 (4) TGF-β1蛋白在正常子宫内膜腺上皮细胞不着色，或胞浆着色，呈棕黄色;在腺上皮阳性着色为细胞核或细胞浆呈棕黄色或棕褐色。
　　 ①治疗前，各实验组与对照组相比均有显著性差异（P值均为0.000）。联合治疗组分别与移植组（P=0.467）和雌激素组（P=0.987）相比均无显著性差异。
　　 ②治疗后1w，各实验组与对照组相比均无显著性差异（P模型=0.098，P移植=0.550，P雌激素=0.075，P联合=0.138）。联合治疗组分别与移植组（P=0.996）和雌激素组（P=0.093）相比均无显著性差异。
　　 ③治疗后2w，各实验组与对照组相比，雌激素组有显著性差异，其余三组均无显著性差异（P模型=0.133，P移植=1.000，P雌激素=0.023，P联合=0.190）。联合治疗组和移植组（P=0.190）相比无显著性差异，和雌激素组（P=0.014）相比有显著性差异。
　　 ④治疗后4w，各实验组与对照组相比均无显著性差异（P模型=0.929，P移植=0.383，P雌激素=0.076，P联合=0.698）。联合治疗组分别与移植组（P=0.866）和雌激素组（P=0.073）相比均无显著性差异。
　　 结论:
　　 1.骨髓间充质干细胞可以在损伤的子宫内膜中存活、迁移，可能作为外源性的干细胞来源修复损伤的子宫内膜。
　　 2.骨髓间充质干细胞移植治疗损伤的子宫内膜，可以从形态学上观察到损伤的子宫内膜基本修复，即子宫内膜腺体数量增加，而间质纤维化面积减少，但子宫组织ESR1蛋白表达量和子宫内膜腺上皮CK蛋白的表达与正常子宫内膜仍存在差异，说明子宫内膜间质细胞的雌激素受体表达仍未完全恢复，腺上皮细胞的表型并未完全修复。
　　 3.用雌激素治疗损伤的子宫内膜后，子宫内膜的腺体数量和间质纤维化的面积也恢复到正常子宫内膜水平，但子宫组织ESR1蛋白表达量仍未恢复到正常水平，子宫内膜腺上皮的ESR1蛋白表达也低于正常水平，说明子宫内膜腺上皮和间质细胞的雌激素表达均未完全修复。
　　 4.用骨髓间充质干细胞移植联合雌激素治疗损伤的子宫内膜后，再生的子宫内膜从形态学和细胞表型方面均和正常的子宫内膜上皮细胞类似，说明联合治疗的方法可能可以完全修复损伤的子宫内膜。
　　 全文小结:
　　 1.应用全骨髓贴壁细胞分离法可以获得纯度较高的骨髓间充质干细胞。PKH26标记骨髓间充质干细胞方法简单，标记率高，是追踪骨髓间充质干细胞在体内迁移，定植和分化的有效方法。
　　 2.子宫内膜条件培养基和不同浓度17β-雌二醇可以诱导骨髓间充质干细胞向子宫内膜方向分化。子宫内膜条件培养基模拟的子宫内膜微环境是诱导BMSCs向子宫内膜分化的关键因素，而雌激素则能够适当调控这种分化效应和分化方向。
　　 3.机械和感染的双重损伤法可以引起兔子宫内膜不可逆的损伤，是一种稳定而有效的建立新西兰大白兔宫腔粘连动物模型的方法。
　　 4.骨髓间充质干细胞移植联合雌激素治疗宫腔粘连模型后，子宫内膜腺体数目明显增加，子宫间质纤维化程度恢复到正常水平。修复后的子宫内膜细胞的表型特征和正常子宫内膜没有较大差异。骨髓间充质干细胞移植联合雌激素治疗能基本修复宫腔粘连中损伤的子宫内膜，或可成为治疗宫腔粘连的新的治疗方案。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 新西兰大白兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定及标记

第一节 目的与意义

第二节 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学处理

第三节 结果

3．1 新西兰大白兔BMSCs的培养

3．2 新西兰大白兔BMSCs表面标志的鉴定

3．3 新西兰大白兔BMSCs的PKH26标记

3．4 细胞凋亡率

3．5 细胞增殖能力

第四节 讨论

4．1 兔骨髓间充质干细胞的分离、培养和纯化

4．2 兔骨髓间充质干细胞的鉴定

4．3 兔骨髓间充质干细胞的PKH26荧光标记

第五节 结论

参考文献

第一章 附图

第二章 兔骨髓间充质干细胞向子宫内膜细胞方向分化的体外实验研究

第一节 目的与意义

第二节 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学处理

第三节 结果

3．1 兔BMSCs诱导分化5d后各组细胞形态学特征

3．2 兔BMSCs诱导分化5d后各组细胞CK18，ESR1和VIMmRNA的表达

3．3 兔BMSCs诱导分化5天后各组细胞CK，ESR1和VIM蛋白的表达

3．4 兔BMSCs诱导分化5天后各组细胞CK蛋白的荧光染色

第四节 讨论

4．1 体外诱导骨髓间充质干细胞多潜能分化的方法

4．2 骨髓间充质干细胞向子宫内膜方向的分化

4．3 骨髓间充质干细胞向子宫内膜细胞方向分化的鉴定

4．4 雌激素在BMSCs体外诱导分化中的作用

第五节 结论

参考文献

第二章 附图

第三章 构建成年雌性新西兰大白兔宫腔粘连动物模型的实验研究

第一节 目的与意义

第二节 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学处理

第三节 结果

3．1 正常子宫内膜形态学特征

3．2 不同方法建模后，子宫内膜形态学变化过程

3．3 建模后7d各组子宫内膜损伤程度分析及最佳建模方案的确定

第四节 讨论

第五节 结论

参考文献

第三章 附图

第四章 骨髓间充质干细胞移植联合雌激素修复子宫内膜损伤的体内实验研究

第一节 目的与意义

第二节 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学处理

第三节 结果

3．1 子宫内膜形态学改变和纤维化程度分析

3．2 移植细胞的存活、分化与迁移

3．3 兔血清雌二醇浓度的变化

3．4 BMSCs移植和雌激素对兔子宫组织CK18，VIM ESR1和TGF-B1基因水平的影响

3．5 BMSCs移植和雌激素对兔子宫组织CK和ESR1蛋白相对表达量的影响

3．6 BMSCs移植和雌激素对兔子宫内膜腺上皮表达CK、VIM、ESR1和TGF-β1蛋白的影响

第四节 讨论

4．1 宫腔粘连概述

4．2 子宫内膜干细胞的存在及来源

4．3 骨髓间充质干细胞的移植、示踪以及在活体内的迁移

4．4 骨髓间充质干细胞移植对损伤子宫内膜修复的影响

4．5 雌激素对损伤子宫内膜修复的作用

第五节 结论

参考文献

第四章 附图

全文总结

攻读学位期间成果

声明

统计学证明