低氧条件下E3泛素连接酶Siah2致慢性髓系白血病伊马替尼耐药机制的初步研究

摘要

背景：慢性髓细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一种起源于造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病(MPD)。CML有特征性的Ph染色体即t(9;22)(q34.1; q11.21)，9号染色体上的原癌基因c-ABL易位到22号染色体的断点集合区域(BCR)，构成了一个BCR-ABL融合基因。其编码的蛋白主要为p210，p210有持续酪氨酸激酶活性，导致Ph阳性细胞持续增殖并凋亡受阻，CML发病。甲磺酸伊马替尼是可以抑制BCR-ABL融合蛋白激酶活性的靶向药物，它的出现使得CML的细胞遗传学和分子生物学缓解率和患者的长期生存都得到了显著改善，开创了分子靶向治疗的新纪元[1]。随着IM的大量应用，我们逐渐认识到，部分患者会出现IM耐药，包括原发耐药与继发耐药，且一旦发生IM耐药，往往是二代甚至三代酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)也不能完全控制病情的进展，或者仅仅可以短期改善，继而病情快速进展恶化，最终死亡[2-4]。目前，IM耐药机制中的BCR-ABL依赖途径包括BCR-ABL融合基因过度扩增，ABL激酶区点突变如T315I突变、P-loop突变等，BCR-ABL诱导的基因组不稳定等是IM耐药的主要原因;BCR/ABL非依赖途径包括药代动力学和药物转运异常、克隆演变、CML干细胞残留及BCR-ABL下游及ABL激酶域以外的功能域异常致异常信号转导通路激活等也是IM耐药的重要原因[5，6]。然而，这些机制也不能完全解释在CML患者发生的IM原发和继发耐药的所有原因。低氧作为一种独立特征广泛存在于各种肿瘤中已日益受到重视，众多研究表明低氧一方面通过刺激微环境表达多种细胞因子使肿瘤细胞自身生物性状调整以适应缺氧环境，另一方面在持续低氧情况下，还可通过诱导细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)等的表达促进血管生成改变微环境，促进肿瘤侵袭和转移，进而介导多药耐药[7-9]。白血病细胞的大量增殖及继发贫血加重骨髓低氧，Roy S等报道严重低氧（0.9％-1.0％），可促使鼠和人造血干细胞的自我更新，另有研究也证明低氧调控CD34+CML细胞的增殖和分化，最新研究发现，低氧维持白血病干细胞处于G0期，进而成为白血病复发的根源，但具体机制尚不清楚。SIAH家族是果蝇sina(seven in absentia)基因产物的类似物，其N端有环形的起催化作用结构域，C端有底物结合域(SBD)，两者之间为两个锌指结构。Siah2是E3泛素连接酶复合物的成员，可介导多种蛋白经泛素-蛋白酶体途径降解。Siah2作用底物的特异性取决于细胞应对的压力类型，它包括TNF-α诱导凋亡过程中的激酶调节因子（TRAF2），Ras/Raf信号转导通路中的激酶调节因子(Sprouty2，SPRY2)，p38/JNK信号转导通路，线粒体生物合成过程中的(OGDC-E2)和低氧调节过程中的脯氨酰羟化酶(PHD1/3)天冬酰胺羟化酶(FIH)等。既往研究提示:在肿瘤发展过程中，距离血管网较远的低氧区域形成。如果此低氧区域持续存在，则导致肿瘤细胞发生低氧反应，Siah2的表达和活性增加，Siah2/PHD/HIF-1α通路转导增强，PHD被降解，低氧反应的中心调控者HIF-1α稳定性增加，上调VEGF、FGF2、HGF等细胞因子的转录水平，促进血管生成，促进肿瘤发生发展。造血干细胞生存的微环境是低氧的（正常成人的骨髓氧分压仅为20mmHg，而正常动脉血氧分压为100mmHg），正如休眠的种子需要保存在干燥、封闭的低氧环境中，以更好地保持再次萌发的潜力。然而白血病干细胞尤其是慢性髓细胞白血病干细胞不仅能利用骨髓造血干细胞的生存条件，而且可以与骨髓微环境中骨髓间充质细胞等各种细胞及其分泌的细胞因子相互作用，发生适应性增强，对药物敏感性降低等改变。越来越多的研究表明，低氧的骨髓微环境可促进白血病干细胞与骨髓基质细胞的相互作用，在介导肿瘤细胞耐药中发挥重要作用，Siah2可能是低氧情况下导致肿瘤耐药的主要分子之一。那么Siah2是否与CML伊马替尼耐药相关呢？其作用机制如何？这正是本课题研究的目的所在。
　　 目的：:探讨Siah2在慢性髓系白血病进展及耐药中的作用机制
　　 方法：⑴临床水平检测:经知情同意，收集慢性髓系白血病患者骨髓原始细胞，其中慢性期4例，进展期3例（包括加速期和急变期患者），使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心方法分离单个核细胞，TRIzol提取总RNA，反转录为c-DNA，以GAPDH为内参，Q-PCR方法检测各个临床标本中Siah2的mRNA表达水平。⑵细胞水平检测:分别培养野生型K562细胞株和耐伊马替尼的K562-R细胞株，于细胞生长对数期收集细胞，TRIzol提取总RNA，反转录为c-DNA，Q-PCR方法检测各个细胞株中Siah2的mRNA表达水平。⑶K562和K562-R细胞的生物学特性分析：药物耐受性分析:在正常氧浓度即21％氧浓度、10％氧浓度和5％氧浓度条件下分别应用CCK-8法检测K562、K562-R细胞对梯度浓度伊马替尼的耐药性，计算细胞抑制率，得出各自IC50值，并行统计学分析。5％氧浓度条件下，6h、12h、24h分别检测K562和K562-R细胞的对梯度浓度伊马替尼的耐药性，计算细胞抑制率，得出各组IC50值，并行统计学分析；细胞凋亡分析:分别以梯度氧浓度处理K562，K562-R细胞，AnnexinV/PI染色结合流式细胞仪术检测低氧处理前后K562和K562-R细胞细胞凋亡率，并行统计学分析。⑷不同氧浓度处理后Siah2、HIF-1α和VEGF的表达水平检测:分别于21％、10％、5％氧浓度条件下培养野生型K562细胞和K562-R细胞，别于培养6h、12h、24h收集细胞，TRIzol提取总RNA，反转录为c-DNA，Q-PCR方法检测各个细胞株中Siah2、HIF-1α和VEGF的mRNA表达水平。蛋白裂解液提取总蛋白，以β-actin为内参，Western blot方法检测细胞株中Siah2、HIF-1α和VEGF的蛋白表达水平。⑸统计学分析:采用SPSS17.0软件包处理数据，各组数据以均数±标准差（)x)±(s)）表示，各实验组细胞之间的比较，若方差齐，则采用单因素方差分析;若方差不齐，采用近似Welch法。组内多重比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐则用Dunnett's T3法，P＜0.05认为差异有统计学意义。
　　 结果：①Siah2在3例IM耐药原代细胞的mRNA表达水平高于4例IM敏感骨髓原代细胞，二者具有显著性差异(P=0.000)。②Siah2在K562-R细胞的mRNA表达水平高于野生型K562细胞，二者具有显著性差异(P=0.008)。③CCK8法检测K562和K562-R细胞对伊马替尼的敏感性均随着氧浓度的降低而降低，K562-R细胞降低更明显。10％氧浓度条件下，其K562细胞的IC50(IC500.1902±0.00219μM)低于K562-R细胞(IC503.2896±0.14820μM)，5％氧浓度条件下，K562细胞的IC50(IC500.2095±0.00116μM)低于K562-R细胞IC50(IC503.4889±0.0115μM)，不同氧浓度条件下，比较两组细胞的IC50值有显著性差异(P=0.000)。5％氧浓度条件下，6h、12h、24h分别检测K562和K562-R细胞的对梯度浓度伊马替尼的耐药性，比较两组细胞不同时间点的IC50值，K562和K562-R细胞对IM的耐药性均随处理时间的延长而增加(P=0.000)，呈时间依赖性，且K562-R细胞耐药性增加更明显。④细胞凋亡分析发现，经21％氧浓度、10％氧浓度和5％氧浓度处理相同时间即24h后，K562-R细胞的凋亡率低于野生型K562细胞((F=697.067，P=0.000))。⑤21％氧浓度、10％氧浓度和5％氧浓度分别处理野生型K562细胞和K562-R细胞后Q-PCR检测两种细胞株Siah2、HIF-1α和VEGF的mRNA表达水平，提示随着氧浓度的降低，Siah2、HIF-1α和VEGF的表达水平在野生型K562细胞和K562-R细胞均增加，但K562-R细胞的表达水平增加的更明显。5％氧浓度培养条件下0h、6h、12h收集的K562和K562-R细胞，Western blot法检测Siah2、HIF-1α和VEGF三种蛋白在两种细胞的表达呈增加趋势，且K562-R细胞表达增加更明显。
　　 结论：⑴Siah2在进展期慢性髓系白血病原代细胞的mRNA表达水平高于慢性期慢性髓系白血病原代细胞，在K562-R细胞中的表达较野生型K562细胞升高。⑵在氧浓度低于正常氧浓度的一定范围内，K562-R和K562对IM的敏感性均降低，且K562-R对IM敏感性降低更明显。⑶梯度氧浓度孵育24h后检测到的野生型K562细胞的凋亡率高于K562-R细胞的凋亡率。⑷梯度氧浓度孵育24h后在野生型K562和K562-R两种细胞中，Siah2、HIF-1α和VEGF的mRNA表达水平均增加，且K562-R细胞的表达水平增加更明显。5％氧浓度处理条件下，K562和K562-R细胞中，Siah2、HIF-1α和VEGF的蛋白表达水平随着低氧处理时间的延长均增加，且在K562-R细胞中增加更明显。

目录

摘要

前言

第一章 Siah2在慢性髓系白血病骨髓原代细胞及细胞株中的表达分析

材料与方法

1 材料

2 实验方法

3 结果分析

4 讨论

5 小结

第二章 不同低氧浓度条件下野生型K562和K562-R的对伊马替尼的敏感性分析和凋亡率的检测

1 材料

2 实验方法

3 结果与结果分析

4 讨论

5 小结

第三章 不同低氧浓度条件下野生型K562和K562-R细胞的Siah2、HIF-1α和VEGF表达分析

1 材料

2 实验方法

3 结果分析

4 讨论

5 小结

全文小结

参考文献

硕士研究生期间主要完成论文

致谢

声明