基于帕金森病小鼠模型的中型多棘神经元功能异常的研究

摘要

帕金森病(Parkinson's disease PD)是一种常见的神经退行性疾病，65岁以上老年人的发病率为1.7％，其中每10万人中每年新增约17例PD患者。帕金森病的主要临床症状表现为静止性震颤、肌肉僵直、行动迟缓和运动不能等，并常常伴有认知障碍、精神症状及其它行为学改变。随着我国社会逐渐进入人口老龄化社会，该病的患病率存在上升趋势，为家庭和社会带来沉重的精神及经济负担，因此对该病的研究也越来越受到人们的关注。
　　 基底神经节是控制和调节运动功能的重要神经元回路，帕金森病的运动功能障碍与基底神经节的运动调节功能异常密切相关，纹状体是基底神经节的最大输入核团，其对维持基底神经节环路:直接通路（纹状体-苍白球内侧部-黑质网状部）和间接通路（纹状体-苍白球外侧部-丘脑底核-苍白球内侧部-黑质网状部）的平衡起到非常重要的作用。纹状体内最主要的细胞类型为中型多棘神经元，其上游主要接收来自皮层和丘脑的兴奋性传入，信息在纹状体经过处理后，通过下游的直接和间接通路传递给运动皮层执行具体运动，然而，这种信息在纹状体的处理是在黑质-纹状体多巴胺投射系统的多重调节之下进行的，调节后的结果是易化强烈信息和抑制随意信息。在帕金森病的病理状态下，黑质的多巴胺能神经元发生退行性病变引起投射至纹状体的多巴胺递质水平严重下降，因而信息在纹状体的处理失去多巴胺的调节，以致传递到下游直接通路和间接通路的信息发生紊乱，最后导致运动功能障碍。以往对与帕金森病的研究多集中在丘脑底核和输出核苍白球上，研究结果也显示这些核团神经元电生理活动发生了一定的改变，但是在此状态下对纹状体中型多棘神经元的电生理活动变化的研究较少涉及，此外，在给予左旋多巴药物治疗帕金森病的过程中会出现左旋多巴诱导的一系列运动功能障碍并发症，这些并发症的分子机制在纹状体中型多棘神经元上是如何体现的，目前也没有很全面的相关报道，因此研究该区域的功能变化将有助于人们更深入全面地理解帕金森病的病理过程以及各种并发症的发病机制。
　　 本研究着眼于纹状体中型多棘神经元，首先检测中型多棘神经元上多巴胺D1和D2受体表达水平的变化，然后研究中型多棘神经元由于缺失多巴胺发生的代偿性变化，最后探测定位于中型多棘神经元突触前膜和胞体上多巴胺受体的功能变化。本研究使用的动物模型是基因敲除导致纹状体严重缺乏多巴胺递质的小鼠和转基因构建绿色荧光蛋白标记纹状体D2中型多棘神经元的小鼠，通过将两种小鼠杂交后，获得具备两种特性的PitxHomo/D2GFP小鼠，这样就能在基因敲除导致多巴胺严重缺失的状态下特异地区分及研究D1和D2中型多棘神经元。首先采用分子生物学半定量和荧光定量PCR的方法，在纹状体内分区域取样本，检测在多巴胺递质缺失的状态下，纹状体内多巴胺D1和D2受体在不同区域表达量的变化;然后通过电生理学膜片钳方法，及后期腹腔注射给予左旋多巴药物治疗，探讨多巴胺缺失引起的纹状体D1中型多棘神经元兴奋性发生的代偿性变化;最后以与水平方向成30度斜角横切脑片的方法保留完整的突触联系，通过电生理膜片钳方法，在给予外源时多巴胺时，研究纹状体中型多棘神经元由于突触前及胞体上的多巴胺受体反应性增强发生的功能性变化。结果如下:
　　 1.半定量PCR检测结果显示纹状体背侧区域内PitxHomo D1和D2受体相对灰度值与PitxWT D1和D2受体的相对灰度值相比，无统计学差异(P＞0.05，P＞0.05);腹侧区域内PitxHomo与PitxWT的D1和D2受体的相对灰度值也无统计学差异（P＞0.05，P＞0.05）。为了确认此结果我们使用荧光定量PCR方法检测，实验结果显示与半定量PCR结果相类似，显示PitxHomo和PitxWT两组动物的背侧和腹侧两个区域的D1和D2受体的表达量无显著性差异(P＞0.05，P＞0.05, P＞0.05 P＞0.05)。
　　 2.在电生理学上，神经元膜的输入电阻(input resistence RIn)是反映了神经元内在的兴奋性的关键参数。在电流钳模式下，通过对D1中型多棘神经元注入一系列阶跃方波电流，获取相应的膜电位值，作电流-电压曲线比较PitxHomo和PitxWT两种动物D1中型多棘神经元的RIn，实验结果显示相同的电流值在PitxHomo D1中型多棘神经元上产生的膜电位值比在PitxWT D1中型多棘神经元上产生的要大(P＜0.05)，根据欧姆定律U=IR，可得知PitxHomo D1中型多棘神经元的RIn增加，兴奋性增强。由于不同的年龄的小鼠神经元的RIn也会有所变化，为了排除年龄因素的干扰，将小鼠分成三个年龄组(14-16days，17-19days，20-23days)进行实验，实验结果显示在不同的年龄组中，PitxHomo D1中型多棘神经元与PitxWT D1中型多棘神经元相比，具有较大的RIn(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)。为了判断是何种因素变化引起PitxHomo D1中型多棘神经元的RIn的增加，通过使用含钾离子通道抑制剂氯化铯的电极内液记录细胞，结果显示由于没有电压依赖性通道的影响，电流-电压曲线变为线性，但PitxHomo D1中型多棘神经元与PitxWT D1中型多棘神经元的RIn的差别仍然存在(P＜0.05)，提示有可能是膜表面面积减少引起PitxHomo D1中型多棘神经元RIn的增加，在接下来的研究工作中我们会通过进一步的实验去确证这种可能性。为了验证PitxHomo D1中型多棘神经元RIn的增加与多巴胺缺失的关系，分别给予同窝出生的两组PitxHomo小鼠左旋多巴药物和生理盐水腹腔注射，结果显示左旋多巴药物治疗组小鼠D1中型多棘神经元RIn有所降低(P＜0.05)。在电流钳模式下，注入电流使D1中型多棘神经元产生动作电位，比较能触发PitxHomo D1中型多棘神经元与PRxWT D1中型多棘神经元产生动作电位的电流值，结果显示PitxHomo D1中型多棘神经元产生动作电位所需的电流值降低(P＜0.05)。电压钳模式下，调整刺激器刺激强度使PitxHomo和PitxWT的D1中型多棘神经元产生幅度一致的兴奋性突触后电流EPSC，然后切换至电流钳模式比较D1中型多棘神经元产生的兴奋性突触后电压EPSP的幅度面积，结果显示PitxHomo D1中型多棘神经元产生的EPSP的面积变大（P＜0.05）。
　　 3.在电流钳模式下，注入电流使D1中型多棘神经元产生动作电位，然后水浴给予外源性多巴胺，观察动作电位数目的变化，结果显示与PitxWT相比，多巴胺引起PitxHomo D1中型多棘神经元动作电位增加的数目变大(P＜0.05)。在接下来的研究工作中，我们会进一步确认是何种离子通道活性的改变导致多巴胺引起PitxHomo D1中型多棘神经元膜电位的变化比PitxWT D1中型多棘神经元膜电位的变化要大。
　　 4.以与水平方向成30度斜角横切脑片的方法保留完整的皮层-纹状体和丘脑-纹状体的突触联系，根据文献报道的皮层-纹状体和丘脑-纹状体突触反应的特征，比较实验所得结果，结果显示以双脉冲刺激比值PPR作为观察值时，刺激皮层诱发D1中型多棘神经元和D2中型多棘神经元产生的PPR＞1，两者无显著性差异(P＞0.05);刺激丘脑诱发D1中型多棘神经元和D2中型多棘神经元产生的PPR＜1，两者无显著性差异(P＞0.05);PitxHomo和PitxWT小鼠比较，两组动物也无显著性差异（P＞0.05）;然而皮层刺激和丘脑刺激相比较，两者有显著性差异（P＜0.05）;以上结果均与文献报道结果相符合，保证了后续实验在稳定可重复的条件下进行。在电压钳模式下，通过刺激皮层，记录纹状体D1和D2中型多棘神经元产生的兴奋性突触后电流EPSC，然后水浴给予外源性多巴胺，观察EPSC幅度的变化，结果显示以产生的第一个EPSC的幅值作为观察值时，与PitxWT相比，多巴胺抑制PitxHomo D1和D2中型多棘神经元产生的EPSC的作用增加(P＜0.05，P＜0.05)，但是多巴胺对D1和D2中型多棘神经元的抑制作用相比较，两者无显著性差异（P＞0.05）。通过刺激丘脑，记录纹状体D1和D2中型多棘神经元产生的兴奋性突触后电流EPSC，然后水浴给予外源性多巴胺，观察EPSC幅度的变化，结果显示以产生的第一个EPSC的幅值作为观察值时，与PitxWT相比，多巴胺抑制PitxHomo D1和D2中型多棘神经元产生的EPSC的作用增加(P＜0.05，P＜0.05)，但是多巴胺对D1和D2中型多棘神经元的抑制作用相比较，两者无显著性差异(P＞0.05)。比较不同刺激区域的结果，刺激丘脑时多巴胺对D1和D2中型多棘神经元的抑制作用明显大于刺激皮层时多巴胺对D1和D2中型多棘神经元的抑制作用（P＜0.05，P＜0.05）。当反应发生在突触前时EPSC的PPR会发生改变，比较多巴胺给药前和给药后在D1和D2中型多棘神经元记录的PPR，结果显示皮层刺激时多巴胺引起D1和D2中型多棘神经元的PPR增加(P＜0.05，P＜0.05)，丘脑刺激时多巴胺引起D1和D2中型多棘神经元的PPR也增加(P＜0.05，P＜0.05)。为了判断是哪种多巴胺受体介导多巴胺的抑制作用，刺激皮层和丘脑，水浴给予D2受体激动剂Ropinirole，结果显示与多巴胺对D1及D2中型多棘神经元的抑制作用相比，皮层刺激时Ropinirole对D1及D2中型多棘神经元的抑制作用无显著性差异（P＞0.05，P＞0.05），丘脑刺激时Ropinirole对D1及D2中型多棘神经元的抑制作用也无显著性差异（P＞0.05，P＞0.05），但丘脑刺激时Ropinirole对D1和D2中型多棘神经元的抑制作用明显大于皮层刺激时Ropinirole对D1和D2中型多棘神经元的抑制作用(P＜0.05，P＜0.05)。比较Ropinirole给药前和给药后在D1和D2中型多棘神经元记录的PPR，结果显示皮层刺激时多巴胺引起D1和D2中型多棘神经元的PPR增加(P＜0.05，P＜0.05)，丘脑刺激时多巴胺引起D1和D2中型多棘神经元的PPR也增加(P＜0.05，P＜0.05)。在电压钳模式下，刺激丘脑，记录纹状体D1和D2中型多棘神经元产生的兴奋性突触后电位EPSP，然后水浴给予外源性多巴胺，观察EPSP幅度的变化，结果显示以产生的第一个EPSP的幅值作为观察值时，与PitxWT相比，多巴胺抑制PitxHomo D1和D2中型多棘神经元产生的EPSP的作用增加（P＜0.05，P＜0.05），但是多巴胺对D1和D2中型多棘神经元的抑制作用相比较，两者无显著性差异（P＞0.05）。
　　 通过以上实验结果，本研究可得出如下结论:
　　 1.多巴胺缺失状态下，纹状体的多巴胺D1和D2受体的mRNA表达量没有发生很明显的上调。
　　 2.多巴胺的缺失使D1中型多棘神经元本身失去活化的条件，这种活化在正常情况下是由于多巴胺配体结合其D1受体引起的。为了代偿这一改变，D1中型多棘神经元发生了适应性变化，比如通过减少神经元的膜表面面积来增加其膜的输入电阻RIn，使其对去极化刺激的反应性增强，兴奋性增加。
　　 3.多巴胺的缺失同时也导致D1中型多棘神经元膜表面上的多巴胺D1受体功能增强，具体表现在与PitxWT相比同样浓度的多巴胺能引起PitxHomo D1中型多棘神经元放电增多。
　　 4.多巴胺缺失导致皮层-纹状体和丘脑-纹状体突触前膜的多巴胺D2受体功能增强，具体表现在与PitxWT相比同样浓度的多巴胺抑制PitxHomo D1和D2中型多棘神经元产生的EPSC的作用增强，其中这种抑制作用在丘脑-纹状体突触表现尤为突出。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 帕金森病小鼠模型大脑基底神经节中多巴胺受体基因表达的分析

第一节 引言

第二节 材料与方法

第三节 结果

第四节 讨论

第三章 帕金森病小鼠模型大脑基底神经节皮层-纹状体及丘脑-纹状体通路突触功能的研究

第—节 引言

第二节 材料与方法

第三节 结果

第四节 讨论

第四章 帕金森病小鼠模型大脑基底神经节D1中型多棘神经元功能的研究

第一节 引言

第二节 材料和方法

第三节 结果

第四节 讨论

参考文献

中英文对照缩略词表

综述 基底神经节与帕金森病

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学证明