肝脏局限性病变的扩散加权成像及双标记巨噬细胞MRI研究

摘要

第一部分、多b值的扩散加权成像在肝脏局限性病变的应用研究
　　 目的：本研究选取5个递增的b值，以ADC、EADC、SI、ADC灶肝比值、EADC灶肝比值、SI灶肝比值为观察指标，探讨扩散加权成像在肝脏局限性病变诊断中的作用。
　　 材料与方法：
　　 1.研究对象
　　 确诊为肝脏局限性病变的病人66例，原发性肝细胞癌20例（34个病灶），转移瘤9例（29个病灶），血管瘤16例（27个病灶），囊肿12例（22个病灶），局灶性结节增生6例（9个病灶），脓肿3例（6个病灶）。
　　 2.扫描方法
　　 所有病人均在3.0 T磁共振仪检查，DWI扫描在T1WI、T2WI、双回波化学位移成像、FIETA成像之后，钆对比剂增强扫描之前进行，取5个b值(200、400、600、800、1000 s/mm2)，采用呼吸屏气方法，分5次扫描，每次在深呼气末开始采集图像。
　　 3.图像分析
　　 图像的分析处理在后处理工作站进行，通过在DWI图、ADC图和EADC图上放置圆形感兴趣区(ROI)，分别测量病灶和肝实质的表观扩散系数(ADC)、指数表观扩散系数(EADC)、信号强度(SI)。再计算这3个指标的病灶与肝实质的比值，即ADC灶肝比值、EADC灶肝比值、SI灶肝比值。
　　 4.统计学分析数值用平均数±标准差表示。某一指标在同一b值的良、恶性病灶间（或两个病种间）的比较，采用两独立样本的t检验。某一指标在同一b值不同病种间的比较，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用LSD法。P＜0.05认为差异有统计学意义。统计软件为SPSS13.0。
　　 结果：
　　 1.各个指标在同一b值的良、恶性病变之间的比较EADC、SI（除了b=200 s/mm2和b=400 s/mm2）、EADC灶肝比值、SI灶肝比值这四个指标中恶性病变的平均值均大于良性病变的平均值，ADC、ADC灶肝比值这两个指标中恶性病变的平均值均小于良性病变的平均值。
　　 2.某一指标在同一b值不同病种间的比较
　　 1) ADC值在同一b值不同病种间的比较各个b值不同病种间的ADC值差异均具有统计学意义。所在b值条件下能检验出病种之间差异有统计学意义的在b=800 s/mm2时个数最多，此时与其他病种差异有统计学意义的个数最多的是囊肿。
　　 2) EADC值在同一b值不同病种间的比较各个b值不同病种间的EADC值差异均具有统计学意义。所在b值条件下能检验出病种之间差异有统计学意义的个数随b值的增加而递增。在b=1000s/mm2时，与其他病种差异有统计学意义的个数最多的是囊肿。
　　 3) SI值在同一b值不同病种间的比较各个b值不同病种间的SI值差异均具有统计学意义。所在b值条件下能检验出病种之间差异有统计学意义的个数在b=600 s/mm2、b=800 s/mm2、b=1000s/mm2时最多。在b=600 s/mm2时，与其他病种差异有统计学意义的个数最多的是囊肿和血管瘤。在b=800 s/mm2、b=1000 s/mm2时，与其他病种差异有统计学意义的个数最多的是囊肿和局灶性结节性增生。
　　 4) ADC灶肝比值在同一b值不同病种间的比较各个b值不同病种间的ADC灶肝比值值差异均具有统计学意义。所在b值条件下能检验出病种之间差异有统计学意义的个数在b=800 s/mm2、b=1000s/mm2时最多。在b=800 s/mm2时，与其他病种差异有统计学意义的个数最多的是囊肿。在b=1000s/mm2时，与其他病种差异有统计学意义的个数最多的是囊肿。
　　 5) EADC灶肝比值在同一b值不同病种间的比较除了b=200 s/mm2时不同病种间的EADC灶肝比值值差异无统计学意义外，其余b值条件下不同病种间的ADC值差异均有统计学意义。所在b值条件下能检验出病种之间差异有统计学意义的个数在b=1000 s/mm2时最多，此时与其他病种差异有统计学意义的个数最多的是囊肿。
　　 6)SI灶肝比值在同一b值不同病种间的比较各个b值不同病种间的SI灶肝比值值差异均具有统计学意义。所在b值条件下能检验出病种之间差异有统计学意义的个数在b=800 s/mm2时最多，此时与其他病种差异有统计学意义的个数最多的是囊肿、原发性肝癌、转移瘤、局灶性结节性增生。
　　 3.各指标在各病种中随b值增加的变化趋势大多数病灶的ADC灶肝比值、EADC灶肝比值、SI灶肝比值随b值增加并无特定趋势。ADC、EADC、SI所有病种均有不同比例病灶表现出特定的趋势。
　　 结论：
　　 1.ADC、EADC、SI、ADC灶肝比值、EADC灶肝比值、SI灶肝比值在不同b值时，良性与恶性病变相比均有明显差异;
　　 2.在肝脏局限性病变的鉴别方面，b值选择800 s/mm2最为适宜;
　　 3.不同病种的鉴别可选取以上部分指标作为参考，如，ADC灶肝比值、SI灶肝比值等，特别是ADC灶肝比值可作为鉴别原发性肝细胞癌与转移瘤的理想指标;
　　 4.综合观察一定b值范围内各指标的变化趋势，对肝脏局限性病变的诊断亦有一定的帮助。
　　 第二部分、钆-罗丹明双标记的巨噬细胞的体外MRI研究研究
　　 目的：
　　 1.优化兔腹腔巨噬细胞培养的方法;
　　 2.应用转染剂聚乙烯亚胺一罗丹明复合物(jetPEI-FluoR)及不同的钆(Gd)类对比剂来对巨噬细胞进行双标记，并比较不同条件下的标记效率;
　　 3.对双标记的巨噬细胞进行MRI成像，观察其体外成像效果。
　　 材料与方法：
　　 1.兔腹腔巨噬细胞的分离与培养新西兰大白兔腹腔灌洗收集细胞，培养2～4小时，巨噬细胞贴壁，洗去未贴壁细胞，以含10％ FBS的RPMI1640培养液正常培养。
　　 2.兔腹腔巨噬细胞的的鉴定制做细胞爬片，固定后进行吉姆萨染色，最后于光镜下观察典型形态，计算贴壁细胞中巨噬细胞的比例。
　　 3.兔腹腔巨噬细胞的标记条件优化
　　 1)不同对比剂、混合比例及孵育时间条件下对巨噬细胞的标记:
　　 取不同的钆类对比剂——钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)、钆双胺(Gd-DTPA-BMA，欧乃影）、钆贝葡胺（Gd-BOPTA，莫迪司）（浓度均为0.5 mol/l），与转染剂聚乙烯亚胺一罗丹明复合物(jetPEI-FluoR)，按10∶1、5∶1、3∶1、1∶1的体积比，按转染剂说明书进行标记，标记时间为3小时、6小时和9小时。
　　 2)标记效果的检测
　　 a)细胞存活率测定细胞接种于96孔板中进行标记，每种条件组合设置6个复孔，同时设置空白对照孔和调零孔。达到设定孵育时间后，进行MTT实验。按此公式计算细胞的存活率=（复孔的OD值-调零孔的OD值）/（空白对照孔的0D值-调零孔的OD值）。
　　 b)细胞标记率测定细胞接种于96孔板中进行标记，达到孵育时间后于倒置荧光显微镜下计算每种组合条件下的细胞标记率，细胞标记率=标有红色荧光的细胞数/该视野下总的细胞数。
　　 4.倒置荧光显微镜观察观察标记后巨噬细胞的形态、荧光强度等。
　　 5.电镜观察
　　 取1×106个细胞，PBS洗涤三次，加入2.5％冷戊二醛（0.1 M二甲胂酸钠缓冲液配制），4℃固定过夜。0.1M二甲胂酸钠缓冲液洗涤，用细胞刮取细胞，离心，富集细胞于Ependoff管中。用1％锇酸进行后固定，4℃1小时。梯度丙酮脱水，Spur树脂包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和橘橼酸铅双染色，透射电镜下观察。
　　 6.钆-罗丹明双标记巨噬细胞
　　 1)细胞接种于10 cm的培养皿中，每皿细胞数约4×106个（培养基10ml）;
　　 2)将150μl钆双胺对比剂稀释于750μl150mM的NaCl中，轻轻摇晃混匀;
　　 3)将30μl jetPEI-FluoR稀释于750μl150mM的NaCl中，轻轻摇晃混匀;
　　 4)将已稀释的转染剂一次性加入已稀释的对比剂中（顺序切勿相反）;
　　 5)迅速摇晃混匀上述液体;
　　 6)室温孵育30分钟;
　　 7)将上述混合物逐滴加入含有巨噬细胞的培养皿中，振荡混匀;
　　 8)于37℃及5％ CO2的潮湿环境中孵育9小时。
　　 7.钆标记巨噬细胞
　　 1)细胞接种于10cm的培养皿中，每皿细胞数约4×106个（培养基10ml）;
　　 2)将150μl钆双胺对比剂稀释于750μl150mM的NaCl中，轻轻摇晃混匀;
　　 3)再取750μl150mM的NaCl加入已稀释的对比剂中，轻轻摇晃混匀;
　　 4)室温放置30分钟;
　　 5)将上述混合物逐滴加入含有巨噬细胞的培养皿中，振荡混匀;
　　 6)于37℃及5％ CO2的潮湿环境中孵育9小时。
　　 8.体外MRI成像
　　 1)取钆-罗丹明双标记、钆标记、未标记的细胞悬液（细胞数为1.6×107个），设为实验组、对照组和空白组，洗涤后收集细胞沉淀和上清液，3T的磁共振仪中成像，测定各管内细胞团块中段的信号强度。
　　 2)取8×106、4×106、2×106、1×106个细胞数的钆-罗丹明双标记细胞，PBS洗涤后将细胞沉淀重悬于20μl的1％琼脂糖中，配成细胞密度分别为4×108/ml、2×108/ml、1×108/ml、5×107/ml的细胞悬液。成像条件同上。再分别选取同等细胞密度的未标记细胞作为对照。
　　 9.统计学分析比较不同的对比剂及转染剂体积比、孵育时间对转染效果（细胞存活百分比、细胞标记率）的影响，应用析因分析，后续两两比较用Turkey法，P＜0.05认为差异有统计学意义。统计软件为SAS9.2。体外MRI成像中实验组、对照组和空白组的细胞团块信号强度的比较，应用析因分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05认为差异有统计学意义。统计软件为SPSS13.0。
　　 结果：
　　 1.兔腹腔巨噬细胞的鉴定光镜下观察可见巨噬细胞的典型形态。本研究兔腹腔灌洗液贴壁细胞中巨噬细胞所占比例约88％。
　　 2.不同条件下标记效果的检测当采用以下条件组合:将钆双胺与jetPEI-FluoR转染剂按5∶1的体积比，与巨噬细胞共同孵育9小时，此时细胞的存活率和标记率均较为理想。
　　 3.荧光倒置显微镜观察明光视野下可见细胞呈圆形、三角形、棱形等形态，荧光光源下可见大部分细胞带有红色荧光标记。
　　 4.电镜观察
　　 钆双胺螯合物粒径约1600nm，包裹在内部的钆颗粒平均粒径约50 nm。将钆双胺与jetPEI-FluoR转染剂按5∶1的体积比，与巨噬细胞共同孵育9小时后，高电子密度的钆颗粒部分被巨噬细胞吞噬后位于胞浆内。
　　 5.标记后巨噬细胞的体外MRI成像
　　 1)实验组、对照组和空白组（钆-罗丹明双标记、钆标记、未标记的细胞）MRI成像在三组细胞沉淀中，实验组的T1WI信号强度最高，对照组次之，未标记组最低。三组细胞上清液信号与水接近。实验组、对照组和空白组细胞团块的信号强度依次为456.87±235.99，91.96±77.81，46.13±30.20，三组的信号强度差异具有统计学差异，通过两两比较，实验组分别与对照组和空白组的信号强度差异均有统计学意义，对照组与空白组的信号强度差异无统计学意义。
　　 2)不同细胞密度的实验组和空白组（钆-罗丹明双标记、未标记的细胞）成像空白组不同密度的细胞悬液的T1WI信号与水接近，而实验组的细胞悬液在T1WI上信号明显增高，当细胞密度为5×107/ml时，MRI仍可显示实验组与空白组的信号差别。
　　 结论：
　　 1.三种对比剂——钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)、钆双胺(Gd-DTPA-BMA)、钆贝葡胺(Gd-BOPTA)均可与转染剂聚乙烯亚胺-罗丹明复合物(jetPEI-FluoR)对兔腹腔巨噬细胞进行双标记;
　　 2.钆双胺与转染剂的体积比为5∶1、孵育时间为9小时为钆-罗丹明双标记兔腹腔巨噬细胞的最佳条件;
　　 3.钆-罗丹明双标记的巨噬细胞在T1加权成像效果优于单纯用钆标记的巨噬细胞;当细胞密度为5×107/ml时，MRI仍可显示钆-罗丹明双标记组与未标记组细胞的信号差别。
　　

目录

摘要

第一部分 多b值的扩散加权成像在肝脏局限性病变的应用

前言

材料与方法

结果

讨论

总结

本研究的创新与不足之处

参考文献

第二部分 钆—罗丹明双标记的巨噬细胞的体外MRI研究

前言

第一章 兔腹腔巨噬细胞的分离、培养与标记

材料与方法

结果

讨论

第二章 标记后巨噬细胞的体外MRI成像

材料与方法

结果

讨论

总结

本研究的创新和不足之处

参考文献

缩写词简表

攻读硕士期间发表的文章

致谢

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