血栓通注射液不良反应物质基础的筛查

摘要

血栓通注射液是近年来广泛用于心血管疾病，以中药三七中提取出来的有效活性成分制成的注射剂。其主要成分为三七总皂苷，具有扩张血管、改善血液循环、增加脑血流量、降低外周血管阻力、扩张冠脉、显著降低心脏后负荷从而降低心肌耗氧量、对机体内瘀血有直接溶解作用、疏通被阻塞血管、改善血管渗透性等作用。临床上对心脑血管系统、内分泌系统、呼吸系统等疾病有良好的疗效。随着血栓通注射液在临床应用的增多，关于其不良反应报道逐渐增加，血栓通注射液安全性备受关注。血栓通注射液在临床上常见的不良反应主要为过敏反应，包括最为多见的皮疹，甚至出现严重过敏性休克、剥脱性皮炎型药疹、大疱性表皮松懈型药疹;其它不良反应包括局部红肿疼痛、皮下出血、发热、关节、肌肉疼痛和低血钾等。
　　 与青霉素等化学药物的过敏反应不同，中药注射剂在使用过程中出现大部分药物过敏反应不是真正意义上的药物过敏，而是类过敏反应，严重威胁使用者的生命安全。中药注射剂出现类过敏的原因有很多，现代研究也只是对注射剂整体进行安全性评价研究，并没有深入揭示其引起不良反应的具体成分。迄今为止，药典推荐的动物体内实验模型不能准确预测中药注射剂的致敏潜能。故临床上中药注射剂类过敏反应的出现屡见不鲜。研究报道称采用建立肥大细胞体外脱颗粒模型，用于中药注射剂类过敏筛查具有一定的意义。目前细胞体外脱颗粒筛选模型多应用各种细胞系建立模型，其检测方法敏感、操作简便，其结果与临床报道有一定的相关性，提示其在评价中药注射剂所致的类过敏反应方面有潜在应用价值。
　　 血栓通注射液的主要有效成分为三七总皂苷，其具有刺激性，可能是主要引起过敏以及溶血发生等不良反应的主要物质基础。至目前为止，国内外大多数文献报道血栓通注射液的药物不良反应研究只是停留在注射剂整体水平，并没有对血栓通注射液出现临床药物不良反应的具体成分进行研究。本课题基于血栓通注射液在心血管疾病上良好的治疗效果以及其在临床中出现的药物不良反应上，对血栓通注射液进行有效部位以及成分的分离，同时应用细胞体外脱颗粒模型和体外溶血实验进行过敏以及溶血物质筛查，试图探寻其引起临床过敏反应的具体部位以及成分。
　　 研究目的:
　　 1、血栓通注射液有效部位及成分的分离;
　　 2、完善P815体外脱颗粒模型;
　　 3、血栓通注射液分离部位以及成分的过敏筛查;
　　 4、血栓通注射液分离部位以及成分的溶血筛查。
　　 实验方法:
　　 1、血栓通注射液有效部位以及成分的分离。以血栓通注射液中主要有效成分三七总皂苷为分离对象，以不同浓度的乙腈-水溶液为流动相在制备液相上进行制备分离，制备溶液浓缩干燥后于-4℃下保存。通过高效液相法对其分离部位以及成分进行定性分析。
　　 2、建立LC-MS/MS法测定中药注射剂对P815细胞脱颗粒后上清液中组胺含量。采用C18柱(4.6 mm×100 mm，3.5μm)进行分离，以体积比为60∶40的乙腈～0.5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.3％甲酸）为流动相，流速0.4 ml/min;在电喷雾正离子化模式下，采用多离子反应检测方式(MRM)进行检测;检测离子对为m/z112＞95、112＞68。几种中药注射剂对P815细胞脱颗粒作用后，取细胞上清液，经过SPE C18固相萃取柱纯化，样品液分别使用LC-MS/MS法和ELISA法测定组胺含量，并比较两者结果差异;
　　 3、P815细胞体外脱颗粒模型的研究。首先比较市场上常用的几种中药注射剂对小鼠成纤维细胞L929、小鼠单核巨噬细胞RAW264.7、小鼠肥大细胞瘤细胞P815三种细胞系的体外细胞毒性情况，以细胞增殖率(RGR)和细胞毒性等级评价为指标综合判断。然后进行几种中药注射剂对P815细胞的体外脱颗粒作用实验，以LC-MS/MS法和ELISA测定法分别测定细胞脱颗粒后上清液中组胺含量，以底物显色法测定细胞上清液中β-氨基己糖酶的含量，中性红染色法测定脱颗粒细胞率，综合三个指标判断几种中药注射剂对P815细胞的脱颗粒效果。
　　 4、血栓通注射液分离部位以及成分的过敏筛查。利用P815细胞体外脱颗粒模型对血栓通注射液分离部位以及成分进行过敏筛查实验。先测定各分离部位以及成分的IC50值，并以其为刺激浓度，通过ELISA法测定组胺释放量，显色法测定β-氨基己糖酶释放量，中性红法测定细胞脱颗粒率。通过三个指标数据综合判断分离部位以及成分对P815细胞的脱颗粒效果。
　　 5、血栓通注射液分离部位以及成分的体外溶血实验。以不同浓度的分离部位与兔血红细胞作用，离心后取上清液，应用分光光度计于575nm下测定各样品的吸光度，计算血栓通注射液各部位的溶血率。
　　 实验结果:
　　 1、血栓通注射液三七总皂苷的部位分离以及成分分离:通过两步制备分离得到:6个部位以及5个单体，单体分别为人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、和单体1（未知）。
　　 2、建立LC-MS/MS法测定中药注射剂对P815细胞脱颗粒后上清液中组胺含量:在优化条件下，样品可在6min内完成分析，细胞液中组胺在4.0～128.0μg/L范围内线性关系良好(R2=0.9979)。定量限(S/N＞10)为1.2μg/L，检出限(S/N=3)为0.3μg/L。在标准品浓度为16、64、128μg/L时，细胞上清液中组胺的平均回收率为90.46％～94.26％，相对标准偏差(n=6)为4.1％～5.9％。同时ELISA法和LC-MS/MS法两种方法测定组胺含量的结果比较，ELISA法的测定结果在数量值上总体略高于LC-MS/MS法测定结果;同时，除了野木瓜、天麻素和复方当归注射液组在统计学有差异外，两种检测方法测定其他中药注射剂组的组胺释放结果统计学均无差异(P＞0.05)。
　　 3、几组中药注射剂对P815细胞的RGR与L929细胞与RAW264.7细胞的RGR相比，统计学有显著性的差异(P＜0.01);而L929细胞与RAW264.7细胞的RGR相比较，统计学没有差异(P＞0.05)。参麦、灯盏花素、野木瓜、复方当归及天麻素五种注射液对L929和Raw264.7两种细胞系的细胞毒性等级均在1级，表示对其没有毒性;同时对P815细胞系的毒性等级在2～3级，表示对其有一定毒性。天花粉蛋白、盐酸川芎嗪两种注射液对对L929和Raw264.7两种细胞系的细胞毒性等级均在2级，表示对其有一定毒性;同时对P815细胞系的毒性等级在2～3级，表示对其有一定毒性。
　　 在被检测的9种注射液中，天花粉蛋白、天麻素和红茴香三种注射液在三项指标的检测中与阴性对照组相比均有显著性差异(P＜0.01)，提示上述3个注射剂品种对P815细胞有较强的脱颗粒作用;盐酸川芎嗪、灯盏花素和野木瓜三种注射液在两项指标上均与阴性对照组相比均显著性差异(P＜0.01);另一指标与阴性组比较有差异(0.01＜P＜0.05)，提示上述注射液对P815细胞可能有一定的脱颗粒作用;复方当归注射液在组胺指标上均与阴性对照组相比有差异(0.01＜P＜0.05);β-氨基己糖酶释放率指标与阴性组比较有显著性差异(P＜0.01)，提示上述注射液对P815细胞可能有一定的脱颗粒作用;相对而言参麦、参芪扶正两种注射液在三项检测指标与阴性对照组相比差异不明显(P＞0.05)，提示上述注射液对P815细胞的脱颗粒作用相对较弱。
　　 4、血栓通注射液的分离部位以及成分对P815的脱颗粒作用:部位2和3、单体人参皂苷Rb1、总皂苷组和阳性组在组胺释放量、β-氨基己糖酶释放率和细胞脱颗粒率三项指标上与阴性组比较均有显著性差异(P＜0.01);说明它们很可能存在一定的促进细胞脱颗粒的物质。部位4在组胺释放量和β-氨基己糖酶释放率两项指标上与阴性组比较有显著性差异(P＜0.01);说明可能两者存在一定促进细胞脱颗粒的物质。人参皂苷Rg1组胺释放量阴性组比较有差异(0.01＜P＜0.05);β-氨基己糖酶释放率指标上与阴性组比较有显著性差异(P＜0.01);说明可能两者存在一定促进细胞脱颗粒的物质。部位1、6和单体1（未知）以及人参皂苷Rd在三个指标上与阴性组比较都没有差异(P＞0.05)，提示上述物质的细胞脱颗粒作用较弱。
　　 5、血栓通注射液的分离部位以及成分体外溶血性实验:三七总皂苷、部位1、2和5的溶血性不明显，只有在高浓度（＞4 mg/ml）下才表现出轻微的溶血性，而较低浓度(＜4 mg/ml)下基本没有溶血性。而总皂苷分离部位2、3、4、6在大于1mg/ml浓度下表观一定的溶血性，在小于1mg/ml溶血性表观不明显。
　　 实验结论:
　　 1、LC-MS/MS法测定中药注射剂对P815细胞脱颗粒后上清液中组胺含量，具有稳定、快速、灵敏，同时与经典ELISA测定组胺方法相比无统计学差异，可用于含量极低的生物样品和大批量样品的检测，为后面中药注射剂对P815细胞脱颗粒作用后细胞上清液中的组胺含量测定提供可靠的方法。
　　 2、P815细胞与非肥大细胞相比，对于中药注射剂引起的细胞毒性更敏感，对于中药注射液类过敏反应的检测与临床结果有较好的相关性，提示P815细胞脱颗粒模型用于中药注射剂类过敏物质的筛查具有一定的可行性。
　　 3、三七总皂苷和部位2、3、4也很有可能存在一定的促进细胞脱颗粒的物质，可能与其极性较小、难溶于水，在三七总皂苷中所占比例较大等有关，同时其均含有含量较大的如人参皂苷Rb1等皂苷成分。人参皂苷Rb1和Rg1说明可能存在一定促进细胞脱颗粒的物质。人参皂苷Rb1属于人参二醇型皂苷，Rg1属于人参三醇型皂苷，两单体在血栓通注射液主要成分三七总皂苷中所占含量最大。部位1和单体1（未知）、人参皂苷Rd和人参皂苷Re的致敏性较弱，其中部位1的极性大，易溶于水，在三七总皂苷中所占比例较少;人参皂苷Re含量较少，且极性较大，易溶与水。综上所述:血栓通注射液对P815的脱颗粒作用可能与其成分的极性大小和部分单体的含量有关。
　　 4、三七总皂苷和部位1在较高的浓度下才具有一定的溶血性，而部位2、3、4、6除了较高浓度有溶血性外，在较低的浓度也表现出较强的溶血性。同时它们溶血性强弱与极性相关，极性越小溶血性越强，反之则越弱。

目录

摘要

第一章 前言

第一节 血栓通注射液的化学成分、药理作用以及其临床范围

第二节 临床不良反应以及原因

第三节 不良反应的防治

第四节 血栓通注射液不良反应物质研究的现状

第五节 本课题思路

参考文献

第二章 血栓通注射液有效部位及成分的分离

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第三章 LC-MS／MS法测定组胺释放量的研究

1 材料与试剂

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

参考文献

第四章 P815细胞体外过敏模型的研究

第一节 几种常用中药注射液对三种细胞的体外毒性试验

1 材料与试剂

2 实验方法

3 统计处理

4 结果

5 讨论

参考文献

第二节 几种常用中药注射液对P815细胞的脱颗粒作用

1 材料与试剂

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

参考文献

第五章 血栓通注射液分离部位及成分对P815细胞的脱颗粒作用

1 材料与试剂

2 实验方法

3 实验结果

4 结果讨论

参考文献

第六章 血栓通注射液分离部位的体外溶血实验

1 实验仪器和材料

2 方法与结果

3 结果

4 结论

参考文献

全文总结

英文缩写

攻读学位期间发表的文章

致谢

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