基于中国人群炎症性肠病患者肠道菌群宏基因组学研究

摘要

研究背景： 肠道菌群与其宿主、外环境相互作用和影响的统一体称为肠道微生态系统。肠道菌群之间形成并保持一定的共生或拮抗关系，通过多种调控系统和途径维持胃肠微环境的稳定和平衡。人体肠道菌群从菌群门水平上来说主要由厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门等构成;从种属水平分类主要有肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、韦荣球菌、链球菌、拟杆菌、梭菌、类杆菌和酵母菌等。与肠道微生物密切相关的疾病包括肠易激综合症、炎症性肠病、肠道肿瘤、感染性腹泻、抗生素相关性腹泻、肠结核、乳糜泻等。此外，酒精性肝病、肥胖、代谢综合征、过敏性疾病等肠外疾病也与微生态失衡有关。 炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's diseae，CD)。其反复发作缓解的慢性病程进展中，逐步出现各种并发症如狭窄、瘘管、脓肿形成、肠梗阻、中毒性巨结肠、肠穿孔甚至癌变。IBD是北美和欧洲的常见病，但我国近十多年来发病率增高，已逐渐成为消化系统常见病和慢性腹泻的主要病因。其病因和发病机制尚不完全清楚，涉及遗传、环境和免疫学因素之间复杂的相互作用，其中肠道细菌在其发病及慢性炎症过程中起重要作用。从幽门螺杆菌感染在消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌的作用中得到启示，我们不能忽视肠道菌群对IBD的影响。 尽管还没有找到一些非致病性细菌或特异性的微生物与CD和UC发病相关，但研究已表明，存在于IBD患者肠道内的菌种与正常人相比，在种类和分布上均具有明显的差异性。特别是拟杆菌可能通过CD4+T细胞，而对遗传学上的易感性宿主具有促进炎症发展的作用。有研究显示，用SSCP技术发现在UC和CD患者中，肠道菌群的多样性较正常对照人群明显降低。应用16SrDNA的单链构象多态性和实时定量PCR的研究表明，CD和UC患者细菌种类的减少主要是由于厌氧菌的丢失。 然而上述绝大部分研究来源于西方、欧美国家，中国人群与西方欧美国家由于遗传基因、地理环境及饮食习惯、生活方式等各方面的差异，肠道菌群必然显著不同。随着人类微生物组计划HMP和MetaHIT计划的展开，发现微生物群落构成在健康人群间存在很大个体差异。2010年有科学家发现健康个体的人群之间，包括双胞胎在内的微生物群落(species-level)远远小于50％，由此可见肠道菌群构成的个体差异多么巨大。 细菌16S rRNA基因是编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，具有高度的保守性。16S rRNA由保守区和9个可变区组成，两者相互交错排列。以16S rRNA为靶分子，针对不同可变区设计引物，在适当条件下进行PCR扩增，便得到扩增后的16S rRNA片段，运用高通量测序技术得到16SrRNA片段，将其与基因数据库信息进行比对，＞97％的相似度，我们将其归属为某种特定的菌属，能够在属、种等水平区别不同的菌属，可以实现对菌属进行快速、微量、准确简便地分类鉴定。利用第二代测序技术对细菌16S rRNA进行检测，能发现培养阴性的、丰富度低的菌属。 基于上述，我们课题组着眼于中国人群炎症性肠病患者，运用宏基因组学研究分析中国人群炎症性肠病肠道菌群的分布特征，为正确、恰当的诊疗和防治炎症性肠病提供理论依据。 研究目的： 宏基因组学研究中国溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)及健康对照组肠道菌群的分布特征，为临床炎症性肠病(IBD)的治疗和益生菌的开发提供理论和实验依据。 研究内容： 本文主要研究中国炎症性肠病患者肠道菌群的分布特征。 对象与方法： 1.研究对象 采集2012年8月至2013年8月间在广州南方医科大学南方医院住院诊断为溃疡性结肠炎和克罗恩病患者的粪便标本，另采集健康志愿者的粪便标本为对照组。采集粪便标本前4周未使用微生态制剂或抗生素。 2.研究方法 1)采集符合纳入标准的溃疡性结肠炎和克罗恩病患者及健康对照组的粪便标本。均于排便后2小时内收集新鲜粪便于灭菌的收集器，5mlEP管分装，-80℃冷冻保存。 2)粪便基因组DNA提取 根据TIANamp Stool DNA Kit(TIANGEN)产品说明书提取粪便基因组DNA。并进行DNA的OD值与浓度测定，-20℃保存备用。 3)PCR扩增细菌16S rRNA V4区域 以16S rRNA V4区域带barcode的通用引物进行PCR扩增，上下游引物分别是967F-GAGTGCCAGCMGCCGCGGTAA与1046R-TTATNCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT。所得PCR产物利用凝胶分析软件BandScan和Invitrogen荧光定量仪进行绝对定量和相对定量后，用QIAquickPCR PurificationKit(Qiagen，German)试剂盒进行纯化，并使用Illuminal Paired-endLibrary Preparation Kit对DNA进行末端修复和接头连接。所得终产物使用QiagenQIAquick Gel Extraction Kit切胶回收纯化后，用Illumina Miseq PE250平台进行基因测序。 4)生物信息学分析与统计学处理 所得基因组测序序列应用BIPES流程（barcoded Illumina paried-end sequencing)进行初步原始序列处理。主要包括四步:第一步，拼接序列;第二步，去除引物;第三步，质量控制;第四步，将所得干净序列用UCHIME筛选嵌合体，并去除嵌合体序列。 采用Two-Stage-Clustring(TSC)分阶段聚类算法将干净序列聚类成操作分类单元（Operational-Taxonomic-Units，OTUs），即区分高丰度序列和低丰度序列，根据序列丰度选择不同的聚类方法。对于获得的OTUs，使用GAST(GlobalAlignment for Sequence Taxonomic)算法对其进行分类。采用UCLUST法计算α多样性，基于Unifrac距离，采用QIME主成分分析;菌群相关性分析中，连续性变量用mantel法，分类变量用anosim法;采用LDA(linear discriminantanalysis)、LEfSe、Galaxy89在线工具寻找有组与组之间统计学差异的Biomarker。其余所有的统计使用SPSS16.0统计学软件进行统计分析。 结果： 1.我们将中国健康人群肠道的菌群序列与与来自美国HMP(humanmicrobiota project)肠道、呼吸道、口腔、皮肤与泌尿生殖道等部位的数据库一起分析，标准化到1000条，做beta多样性，对unifrac距离进行主成分分析(PCoA)，分析得到标准化和未标准化的聚类结果。中国人群与西方国家人群的肠道菌群聚集方向一致，但能与HMP肠道菌群明显区分，且来自肠道的样品能和来自其他人体部位显著分开，聚集在特定的区域。中国人群肠道菌群α多样性高于西方国家，亦明显高于人体其他部位的菌群。从菌群结构门水平进行比较，相对于美国HMP肠道菌群，我们中国人群Firmicutes门和Proteobacteria门含量更丰富，但Bacteroidetes门较少。在种属水平上，和美国HMP肠道菌群相比，中国人群肠道菌群Bacteroides菌（拟杆菌属）含量较少而Prevotella（普氏菌属）相对较多。值得注意的是，我们中国人群肠道“others”（其他种属）远远高于美国HMP菌群，这也进一步证实了中国人群肠道菌群多样性明显高于西方国家菌群。 2.我们共纳入克罗恩病72例（男39例，女33例，平均年龄32岁），其中合并瘘管性病变12例，回肠末段病变24例，结肠病变14例，回结肠34例;溃疡性结肠炎51例，男28例，女23例，平均年龄42岁，直肠型病变10例，左半结肠型14例，广泛结肠型27例。 3.无论是克罗恩病(CD)还是溃疡性结肠炎(UC)，与健康对照组相比，α多样性指数均较健康对照组(HC)低，且UC下降更明显，均有显著性差异(p＜0.05)。而溃疡性结肠炎(UC)与克罗恩病(CD)组之间比较，UC组多样性较CD组稍低，但无统计学差异(p＞0.05)。β多样性分析，无论是UC还是CD，与正常对照组的菌群有明显差异，但UC与CD两者之间稍有区分。 4.细菌群落结构门水平:溃疡性结肠炎(UC)与克罗恩病(CD)患者与健康对照相比，Actinobacteria和Proteobacteria门显著增高，以UC尤为明显，而Firmicutes和Bacteroidetes菌门减少。Fusobacteria菌门在溃疡性结肠炎(UC)与克罗恩病(CD)组中均比正常组高，尤以克罗恩病(CD)明显。 细菌群落结构纲水平:炎症性肠病组中(包括UC和CD)，Bacteroidia和Clostridia纲较正常对照组均下降，其中，溃疡性结肠炎(UC)中Bacteroidia下降较克罗恩病(CD)明显，而Clostridia纲两者丰度值相近;Actinobacteria纲、Bacilli纲、Coriobacteriia纲及Gammaproteobacteria纲水平菌群丰度较正常组增高，前3种纲以UC组升高更为明显，而Gammaproteobacteria纲两组丰度值相近。Fusobacteriia纲UC与CD组均较正常组高，尤以CD组升高显著。 细菌群落结构科水平:和健康对照组相比，在UC和CD组中，Proteobacteria菌门中的 Enterobacter科和Firmicutes菌门中的 Streptococcaceae科明显升高，而Firmicutes菌门中的Enterococcaceae科，Lachnospiraceae科，Ruminococcacea科及Bacteroidetes菌门中的Prevotellaceae科显著下降，UC与CD组间丰度值无明显差异。而UC患者Bifidobacteriace科较正常组及CD组高，CD与健康对照组间无明显差异。 细菌群落结构种属水平:在UC和CD组，Prevotella菌，Roseburia菌，Ruminococcus菌及Lachnospira菌均较HC组显著下降，且Ruminococcus在CD组下降更明显;而Enterococcus，Streptococcus，X.Ruminococcus，Veillonella均较HC组明显增高，Fusobacterium菌和Pseudomonas较HC亦高，且以CD组更为显著;CD组中，Bacteroides和Parabacteroides较UC和HC组增高，而Clostridium和Enterococcus在UC组中较HC升高，CD组中变化不明显。 OUT水平差异种属:我们共找到了14个有统计学差异的OTU，分别对应Lachnospiraceae(毛螺菌科)，Ruminococcaceae(瘤胃球菌科)，Lachnospira（毛螺菌属），Roseburia（罗斯伯里氏菌属），Faecalibacteriums_prausnitzii（柔嫩梭菌），Phascolarctobacterium(考拉杆菌属)。虽然CD与UC差异不太显著，但均与健康对照明显区分，丰度值明显下降。有趣的是，这些OUT对应的菌群无一例外全部属于Clostridiales（梭菌目），由此可知IBD患者Firmicutes（厚壁菌门）Clostridiales（梭菌目）及其科属菌群明显下降。 微生物群落统计学分析及生物标志物的寻找:LEfSe统计结果显示，溃疡性结肠炎(UC)主要富集Actinobacteria和Proteobac

目录

摘要

引言

材料与方法

1．研究对象

2．主要试剂与仪器

3．方法

结果

1．中国人群肠道菌群与西方国家人群比较

2．中国人群炎症性肠病患者临床资料

讨论

全文总结与展望

参考文献

缩略词注释表

攻读学位期间成果

综述 肠道菌群对炎症性肠病发病、发展及预后的影响

致谢

声明