正常与退变人髓核间充质干细胞分离鉴定与细胞活性的对比研究

摘要

背景： 椎间盘退变性疾病(degenerative disc disease，DDD)是骨科常见病、多发病，是引起的下腰痛的主要病因之一。DDD以腰腿痛为主要临床表现，其严重影响患者的工作及生活。目前针对DDD导致的腰腿痛主要采取保守治疗或外科手术的方法。保守治疗虽能暂时缓解临床症状，但存在病情反复，远期疗效并不理想的问题，而以摘除髓核并椎间盘融合的手术治疗虽然能彻底解决责任节段的退变问题，但仅适用于退变中晚期患者，并且存在术后并发症的可能。例如，由于手术固定病变节段而影响脊柱原本的生物力学特征，加速相邻节段椎间盘退变而导致远期邻椎病的发生。另外，目前临床应用的新技术，如人工椎间盘、髓核置换技术等也难以完全模拟和替代椎间盘复杂的生物力学功能，因此也同样存在并发症和远期疗效不佳的问题。相比之下，采用干细胞治疗技术修复退变的椎间盘，是治疗早中期椎间盘退变的理想途径。椎间盘退变病因学相关研究表明，椎间盘退变是由于椎间盘在长期应力作用下，积累性损害导致椎间盘内基质金属蛋白酶及抑制因子比例失衡，炎症因子调节其他因子的异常表达，造成椎间盘内细胞活性降低、数目减少，最终造成椎间盘基质成分合成与分解失衡。椎间盘干细胞治疗是指向退变的椎间盘内移植干细胞并使其诱导分化为具有髓核细胞类似表型的细胞以增加椎间盘内细胞基质分泌而延缓或逆转椎间盘退变。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我复制及多向分化潜能的特殊前体细胞，它可以在一定条件下向多种功能细胞，如骨、软骨、血管、肌肉、脂肪、韧带、神经、肌腱等体细胞诱导分化;而且免疫源性弱，是理想的椎间盘移植细胞来源。目前椎间盘退变的治疗相关干细胞主要是骨髓或脂肪来源间充质干细胞，但是作为外源性细胞，其可能无法耐受椎间盘内高压、低营养、高渗透压的恶劣环境。 成人髓核组织中是否存在内源性间充质干细胞，对此问题目前国内外尚无统一认识。但有一些证据提示它的存在:1.Hohaus报道应用成年人退变髓核组织体外培养后回植，发现椎间隙高度增加，髓核组织再生明显，其修复作用有可能来源于髓核间充质干细胞的分化。2.最近，Risbud等从轻度退变的椎间盘组织中分离并证实了椎间盘中含有骨骼前体细胞（或称骨髓间充质干细胞样细胞）。3.Blanco等同样发现椎间盘内存在干细胞，并将其命名为髓核间充质干细胞(NP-MSC)4.本课题组前期实验发现椎间盘内存在一种可以长期传代而不发生凋亡的细胞，同样提示髓核间充质干细胞的存在。 本研究拟分别从正常和退变的人髓核组织分离提取髓核间充质干细胞(nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells，NP-MSCs)，观察其细胞形态学，检测其细胞免疫表型及是否具有多向分化潜能，鉴定分离提取的细胞是否具有干细胞特性，为椎间盘退变性疾病的治疗提供一种理想的种子细胞来源。在明确髓核内存在内源性干细胞后，并比较正常与退变来源髓核间充质干细胞在细胞活力及干细胞相关基因表达是否存在差异。 目的： 1、分别从正常和退变髓核组织分离培养内源性干细胞并对其多向分化能力和表面抗原标志进行鉴定，以明确正常和退变髓核组织内是否均含有髓核间充质干细胞。 2、明确正常与退变髓核间充质干细胞在细胞活性及干细胞相关基因表达方面是否存在差异。 方法： 取正常来源（腰椎爆裂骨折4例，先天性脊柱侧弯2例）与退变来源（腰椎间盘突出症患者6例）的术中摘取的椎间盘髓核组织，无菌储存于D-Hanks液中，2-6℃保存并转移至细胞培养室。在超净台中对椎间盘髓核组织进行分离，仔细去除周围纤维环组织后剪切成约1 mm3大小碎块，浸于浓度为0.2％Ⅱ型胶原酶溶液中，置37℃恒温温箱内消化8小时，2500rpm离心10分钟，弃上层上清，加入含10％胎牛血清的标准间充质干细胞扩增培养基，于37℃，5％CO2条件下培养。于细胞融合达到80-90％时进行传代培养。传代后继续使用含10％胎牛血清的标准间充质干细胞扩增培养基继续培养，每3天进行换液。倒置相差显微镜观察细胞形态。取第3代生长良好的细胞，接种于96孔板，分别于第0，1，3，5，7，9，11，13天各取3孔，加入CCK-8测定正常与退变来源细胞的细胞活性。取P2代细胞进行高速流式细胞学检测细胞免疫表型(CD34/CD45/CD105/CD73/CD90/HLA-DR)。各取一例正常与退变来源的稳定增殖的第3代髓核间充质干细胞进行成脂、成骨、成软骨三系诱导分化实验。应用赛叶(Cyagen)公司提供的人间充质干细胞成骨、成脂肪及成软骨诱导培养方法进行诱导，诱导分化28天后分别进行茜素红、油红O、甲苯胺蓝染色评估分离提取的细胞是否具有成骨、成脂肪及成软骨三系分化潜力。另外，取各例P3代髓核间充质干细胞提取细胞总RNA进行反转录获得cDNA，利用Real-TimePCR检测其干性相关基因Oct4及Nanog表达情况，管家基因GAPDH作为内参，以退变来源髓核间充质干细胞作为对照组，利用2-△△Ct方法计算基因相对表达变化。 结果： 正常与退变来源细胞原代培养3至5天即可见部分细胞贴壁生长，形态主要为短棒样，内夹杂少量多角形细胞，培养至10天左右可见少许形成细胞集落，培养至3周时细胞融合可达到90％。传代后细胞增殖速度明显加快，6至7天即可进行传代，细胞为梭形，形态一致，细胞呈漩涡状生长，传至6代增殖能力未见明显下降。CCK-8细胞活性测定显示正常来源细胞活性明显强于退变来源细胞。流式细胞分析细胞免疫表型结果表明，正常与退变来源细胞均强阳性表达间充质干细胞表面抗原标记分子CD105/CD90/CD73，其阳性率均大于95％，而造血干细胞表面标记CD34/CD45/HLA-DR均呈低表达，表达率均低于5％。三系诱导分化结果显示正常与退变来源细胞成骨诱导28天后细胞表面存在钙盐沉积，茜素红染色可见大片红染的钙结节;成软骨诱导分化28天后正常来源与退变来源细胞均可以形成软骨微球，固定切片后甲苯胺蓝染色可见明显蓝染的软骨细胞。成脂肪诱导分化28天后正常来源与退变来源细胞间可见脂滴形成，油红O染色后可见明显红染的脂滴。Real-Time PCR检测结果显示，正常来源髓核间充质干细胞Oct4基因为退变组表达量的4.63±1.17倍，Nanog基因正常组表达量为退变组的7.36±1.19倍。相对于对照组，正常组髓核间充质干细胞的基因Otc4及Nanog相对表达均显著提高(P＜0.05)。 结论： 正常与退变的人髓核组织内均存在髓核间充质干细胞。通过贴壁生长及间充质干细胞扩增培养基分选法可从中提取髓核间充质干细胞，该细胞形态呈梭形，漩涡状生长。流式细胞分析检测细胞免疫表型显示细胞表达间充质干免疫表型CD105/CD90/CD73，不表达造血干细胞免疫表型CD34/CD45/HLA-DR，符合间充质干细胞表型特性。而诱导分化结果显示正常与退变来源细胞均可以完成向脂肪、软骨及骨细胞的诱导分化，具有三系分化潜能。细胞增殖及细胞活性检测显示退变髓核间充质干细胞在细胞增殖活性方面较正常来源髓核间充质干细胞存在一定减弱。而干细胞相关基因表达方面正常来源髓核间充质干细胞同样强于退变来源髓核间充质干细胞。提示髓核间充质干细胞活性随椎间盘退变的发生存在细胞生物学功能的下降。

目录

摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一章 髓核间充质干细胞的分离培养及鉴定

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

5．附图

第二章 髓核间充质干细胞活性及干细胞相关基因的检测对比研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

附综述：椎间盘内源性干细胞的研究进展

中英文对照缩略词表

成果

致谢

声明