丝素蛋白--壳聚糖缓释微球的制备与表征

摘要

微球和微囊被广泛运用于生物材料和药剂学中[1]，微球和微囊可以作为药物或者细胞生长因子的包裹材料，使药物或生长因子能够长时有效地缓慢释放，从而延长药物的作用时间，使药物能够靶向作用于细胞和组织。近些年来，缓释微球或者微囊的研究很多，许多研究者做了大量的工作，目前的研究重点在于选用毒副作用更小的生物材料，如何减少初期爆释和延长缓释周期等。 丝素蛋白是由蚕丝脱胶而得到的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70％-80％，富含丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸等18种氨基酸，具有良好的生物相容性、生物降解性、能够支持细胞的黏附、迁移和增殖。丝素蛋白有SilkⅠ和SilkⅡ两种构象，SilkⅠ=包括无序卷曲状和α螺旋状，SilkⅡ是反平行的β折叠状[2]，β结构的增加使丝素蛋白构成的复合物更加稳定。丝素蛋白因其独特的加工成型性、生物相容性和生物降解性，广泛被用于组织工程中的支架材料和控释系统的载体中[3]。但是以单一的丝素蛋白作为微球或微囊材料，没有克服初期爆释包载物，丝素蛋白较脆以及机械性能不佳等缺点[4-8]。 壳聚糖是由甲壳素脱乙酰得来，是天然中存在的唯一的碱性亲水多糖，壳聚糖的来源广泛，无毒性无不良反应，有良好的生物相容性、可降解性、良好的可塑性和抑菌性，抗凝血及促进伤口愈合的能力，被广泛的用于药剂学或者生物材料中作为缓释材料[9]。单纯的壳聚糖作为载体时，其药物的装载率较低[10]，为了克服这一缺点，有研究就将其它材料与壳聚糖复合，进行改性，对比单壳聚糖微球，复合微球的载药率更高以及其释放效率更佳[11]。因此，我们猜想以丝素蛋白和壳聚糖复合相互改性，使得丝素蛋白和壳聚糖的理化性能更佳，能够减少包载物的初期爆释，微球的释放效率更佳。 京尼平是一种天然交联剂，是从栀子中提取出来的，一种白色晶体，溶于水的具有双官能团的交联剂。当它与具有氨基的聚合物反应时，会从白色变成深蓝色，京尼平这种天然的交联剂比常用的交联剂，如戊二醛，毒性要小了近10000倍[12]，H.C.Liang[13]等将壳聚糖微球注入到大鼠模型中发现以京尼平交联的微球比戊二醛交联的微球有更好的组织愈合性和更为缓慢的降解性，在药物缓释方面，以戊二醛交联白蛋白，多糖或者明胶制备的微球其生物相容性比京尼平交联制备的这些微球要差较多。并且有报道认为京尼平作为交联剂能有效地改进材料的机械性能[14]，如以京尼平交联制备的丝素蛋白/壳聚糖海绵，其稳定性有了明显的提升而且具有较好的生物相容性[15-16]。 以京尼平交联制备的丝素蛋白/壳聚糖缓释微球并没有报道过。本课题以丝素蛋白，壳聚糖和京尼平作为合成微球的生物材料，研制新颖的缓释微球，并以牛血清白蛋白作为模型药物包载，对其表观，理化性能和缓释效能进行评价，为包载其它药物模型，细胞及动物实验提供实验数据。 第一部分以京尼平交联的丝素蛋白-壳聚糖微球的制备与表征 目的 制备丝素蛋白-壳聚糖微球，考察微球的表观形态、粒径、溶胀率和表征微球特性，探索制备微球时，丝素蛋白与壳聚糖最佳的比例及交联剂京尼平最佳的量。 方法 1.以乳化交联法，京尼平为交联剂，按丝素蛋白和壳聚糖不同的比例（比例为壳聚糖∶丝素蛋白=1∶1，1∶0.5，1∶2）以及不同的京尼平质量(0.01 g，0.05 g，0.1g，0.5g，1 g)进行交叉组合，制备丝素蛋白-壳聚糖微球; 2.通过扫描电镜筛观察制备得出的微球形态，选出形态最佳的微球; 3.以激光粒径分析仪分析微球的粒径; 4.取干燥的质量Wd=0.1g的丝素蛋白-壳聚糖微球悬浮于装有5ml的去离子水离心管中，在摇床上以100 r/min中温和地震动，然后每隔一段时间(0.5 h，1h，2h，4h，6h，8h，10h)离心后，用滤纸擦拭溶胀微球表面的水分，立即称重质量为Ws，溶胀率公式如下:Esw(％)=[(Ws-Wd)/Wd]*100％平衡水含量公式如下:EWC(％)=[(Wc-Wd)/Wc]*100％Wc为溶胀的微球在平衡水含量时的质量，试验重复三次。 5.X-射线衍射及傅里叶红外光谱对微球的物理化学性质进行表征分析。 结果 1.以京尼平1g，CS∶SF=1∶1;京尼平0.05 g，CS∶SF=1∶1;京尼平0.5 g，CS∶SF=1∶2;京尼平0.5 g，CS∶SF=1∶0.5;京尼平0.1g，CS∶SF=1∶0.5，这五种比例制备出的微球，形态较为规则，表面较光滑，粒径分布均匀，其中以京尼平0.05 g，CS∶SF=1∶1制备出微球，其表面形态最为平滑，规则，各个微球最为均一，单从形态学来看，推测可能以此种比例制备的微球最佳。 2.激光粒径分析仪示五组微球粒径分别为(71.13±0.85μm)，(146.60±3.46μm)，(74.09±1.07μm),(89.00±1.08μm)和(109.83±2.28μm)。 3.所有制备出来的微球，在浸入去离子水6小时以后，其溶胀率都达到了平衡。五组微球的平衡水含量分别为60.10±0.48％，63.34±1.29％，58.33±0.35％，58.67±1.45％和59.6±2.19％，其中京尼平0.05 g，CS∶SF=1∶1制备出的微球平衡水含量与其余四组微球平衡水含量有显著性差异(P＜0.05)。 4.傅里叶红外光谱分析证实，京尼平将丝素蛋白和壳聚糖的酰胺基Ⅱ(NH2)交联，证明了丝素蛋白和壳聚糖并不是简单的混合，而是以交联氨基的形式复合。此外，丝素蛋白与壳聚糖相互改性，丝素蛋白的结构从α螺旋状或者无序卷曲状改变为β折叠状。 5.X-射线衍射分析证实结果与FTIR的检测结果一致，说明，丝素蛋白和壳聚糖不是简单的物理混合，它们通过京尼平的交联，发生一定上的结构变化，丝素蛋白从无序卷曲状或者α螺旋状转化为稳定的β折叠状，其结晶度和规整度得到了一定程度上的提高;丝素蛋白和壳聚糖之间发生了一些化学键的结合。 结论 以合适的比例混合丝素蛋白和壳聚糖，并加入一定剂量的京尼平，通过无机乳化交联法能够制备出物理化学性质较佳的丝素蛋白-壳聚糖微球。 第二部分以京尼平交联包载牛血清白蛋白的丝素蛋白-壳聚糖微球的制备与表征 目的 以京尼平交联制备丝素蛋白-壳聚糖微球，BSA作为模型蛋白，评价丝素蛋白/壳聚糖微球的物理化学性质及缓释能力。 方法 1.以乳化交联法，京尼平为交联剂，加入不同质量的BSA(10 mg，20 mg，50 mg)，制备缓释BSA的丝素蛋白-壳聚糖微球; 2.通过扫描电镜观察微球表面形态并在有标尺的扫描电镜视野下，随机选择有代表性的区域，计算200个微球粒径，以统计学处理得出微球粒径; 3.X-射线衍射，傅里叶红外光谱以及热重分析对微球表征分析; 4.以BCA法测定三组微球的包封率，载药率:取适量制备微球时的离心液及洗涤液，用BCA微量蛋白测定法测定离心液及洗涤液中的BSA含量，按照如下公式计算微球的包封率和载药率。包封率=（投入BSA的量-离心液及洗涤液中BSA的量）/投入BSA的量*100％;载药率=（投入BSA的量-离心液及洗涤液中BSA的量）/微球质量*100％ 5.以BCA法测定三组微球21天的累积缓释率:称取含BSA1.5 mg的微球粉末，悬于15 ml离心管中，加入10 ml PH值为7.4的PBS缓冲液，将离心管置于摇床中，摇床以水平式100r·min-1摇动，在第1，2，4，8，14和21天，取上清液20μl，以BCA微量蛋白测定法测定上清液中的BSA含量。累积释放率=上清液中BSA的释放量/微球中的含药量*100％ 结果 1.以京尼平交联制备的丝素蛋白-壳聚糖微球，表面较光滑，为规则的球形大小均匀，微球稍有粘连，其中投入10 mg的牛血清白蛋白合成的微球形态最为规则光滑。三组微球的粒径分别为7.84±0.97μm，7.53±1.15μm和6.52±0.92μm 2.傅里叶红外光谱分析证实，京尼平将丝素蛋白和壳聚糖的酰胺基Ⅱ(NH2)交联，证明了丝素蛋白和壳聚糖并不是简单的混合，而是以交联氨基的形式复合，说明丝素蛋白与壳聚糖相互改性，丝素蛋白的结构从α螺旋状或者无序卷曲状改变为β折叠状。BSA与壳聚糖，丝素蛋白和京尼平间没有发生反应，BSA被包载进微球中。 3.X-射线衍射分析证实，丝素蛋白和壳聚糖不是简单的物理混合，它们通过京尼平的交联，发生一定上的结构变化，丝素蛋白从无序卷曲状或者α螺旋状转化为稳定的β折叠状，其结晶度和规整度得到了一定程度上的提高;10mg组的BSA的特征峰消失，说明了BSA是以非晶状形态包载于微球中的，而50 mg和20mg组有部分BSA特征峰未消失，可能是因为投药量较大，BSA没有完全包载进微球中并有大部分的BSA粘附于微球表面。 4.热重分析证实，BSA被包载进丝素蛋白/壳聚糖微球中，BSA与壳聚糖，丝素蛋白和京尼平间没有发生反应。 5.BCA微量蛋白测定，10 mg，20 mg和50 mg微球组的包封率分别为50.16±4.32％，56.58±3.58％和42.19±7.47％，载药率分别为1.25±0.11％，2.83±0.18％和5.27±0.93％。21天的累积释放率分别为79.16±4.31％，75.2±2.53％和89.04％±4.68％。 结论 以京尼平交联制备的丝素蛋白-壳聚糖微球，随着BSA的投入量增加，包封率下降，当投入BSA的量过大时，会有较多的BSA粘附于微球表面。微球的缓释能力显著，缓释复合Higuchi方程。 第三部分包载BSA的丝素蛋白-壳聚糖微球与纯壳聚糖微球的缓释效能对比研究 目的 对比包载BSA的丝素蛋白-壳聚糖微球和纯壳聚糖微球的缓释效能。 方法 1.以乳化交联法制备空白丝素蛋白-壳聚糖微球，包载10 mg BSA的丝素蛋白-壳聚糖微球和纯壳聚糖微球; 2.通过扫描电镜观察微球表面形态; 3.以BCA法测定该两组载药微球的包封率，载药率和21天的累积缓释率。 结果 1.包载BSA丝素蛋白-壳聚糖和单纯壳聚糖微球比空白微球更加光滑完整，为规则的球形大小均匀，而空白微球稍有凹陷。 2.以BCA法测得包载BSA的丝素蛋白-壳聚糖微球的包封率为50.16±4.32％，载药率为1.25±0.11％;纯壳聚糖微球的包封率为52.77±1.26％，载药率为2.64±0.06％。 3.包载BSA的丝素蛋白-壳聚糖微球，在第一天爆释了总量的30.79±3.43％，而纯壳聚糖微球释放了39.53±1.76％。在第二十一天，丝素蛋白/壳聚糖微球总共释放了总量的75.20±2.52％，纯壳聚糖微球释放了83.57±2.33％。 结论 丝素蛋白-壳聚糖微球比单纯的壳聚糖微球的包封率和载药率要低一些，但是微球初期包载物的爆释量比单纯壳聚糖微球要低，丝素蛋白/壳聚糖微球的缓释性能比单纯的壳聚糖微球要更加平稳。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 微球和微囊的材料分类

1．1．1 可降解的人工合成高分子材料

1．1．2 可降解的天然高分子材料

1．2 理想的微球微囊材料的要求

1．3 微球材料的选择

1．3．1 丝素蛋白

1．3．2 壳聚糖

1．3．3 京尼平

1．3．4 牛血清白蛋白

1．4 本论文的研究内容

第二章 以京尼平交联的丝素蛋白-壳聚糖微球的制备与表征

2．1 材料及方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 丝素蛋白-壳聚糖微球的表征

2．2．1 反应体系的变化

2．2．2 微球表面形态研究

2．2．3 微球的粒径分析

2．2．4 微球溶胀率(Esw)和平衡水含量(EWC)研究

2．2．5 微球的傅里叶变换红外光谱(FTIR)研究

2．2．6 微球的X-射线衍射学(XRD)研究

2．3 统计学分析

2．4 结果

2．4．1 反应体系的变化

2．4．2 微球的扫描电镜结果

2．4．3 微球的粒径分析和溶胀率结果

2．4．4 FTIR分析结果

2．4．5 XRD分析结果

2．5 讨论

2．6 结论

第三章 以京尼平交联包载BSA的丝素蛋白-壳聚糖微球的制备与表征

3．1 材料及方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 丝素蛋白-壳聚糖缓释微球的表征

3．2．1 微球表面形态研究和粒径分析

3．2．2 微球溶胀率，包封率和载药率

3．2．3 微球的傅里叶变换红外光谱(FTIR)研究

3．2．4 微球的X-射线衍射学(XRD)研究

3．2．5 微球的热重分析

3．2．6 微球的体外释放实验

3．3 统计学分析

3．4 结果

3．4．1 微球的表面形态和粒径分析结果

3．4．2 微球的包封率，载药率和溶胀率

3．4．3 FTIR分析结果

3．4．4 XRD分析结果

3．4．5 热重分析结果

3．4．6 包载BSA微球的体外释放的结果

3．5 讨论

3．6 结论

第四章 包载BSA的丝素蛋白-壳聚糖微球与纯壳聚糖微球的缓释效能对比研究

4．1 材料及方法

4．1．1 实验试剂

4．1．2 方法

4．2 三组微球的表征

4．2．1 微球表面形态研究

4．2．2 微球溶胀率，包封率和载药率

4．2．3 微球的体外释放实验

4．3 统计学分析

4．4 结果

4．4．1 微球的表面形态

4．4．2 微球的包封率，载药率和溶胀率

4．4．3 包载BSA微球的体外释放结果

4．5 讨论

第五章 全文总结

第六章 不足与展望

参考文献

综述 基于丝素蛋白-壳聚糖的骨组织工程材料

在读期间研究成果

致谢

声明