新型螺环取代的氨基吡啶类化合物SMU--B抗肿瘤作用及其作用的分子机理研究

摘要

肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor，HGFR），又称c-Met(mesenchymal-epithelial transition，MET)，是在80年代发现的原癌基因产物，现已确定为受体酪氨酸激酶家族中的成员。HGF最初是作为大鼠肝细胞丝裂原(mitogen)而被发现，其作用与扩散因子(scatter factor)相似。现已证明，HGF主要由基质细胞产生，通过其受体c-Met，能刺激上皮细胞等细胞的增殖，运动，形态发生（morphogenesis）和血管生成。 在正常生理情况下，HGF与受体c-Met结合导致受体激酶区的酪氨酸发生磷酸化，进而导致受体及其下游信号通路的激活，在维持机体器官的发育和组织内环境稳定中发挥重要的作用。然而，HGF异常分泌，c-Met突变，扩增（amplification）以及高表达导致的c-Met通路的异常激活，可引起c-Met受体的持续激活与磷酸化，从而持续不断地激活下游信号通路，导致细胞的异常增殖，诱导正常细胞向癌细胞转化。 有许多方法用来抑制异常的HGF/c-Met信号通路，包括:HGF环状异构体拮抗剂(HGF variant antagonist)，HGF抗体拮抗剂(HGF antibody antagonist)，c-Met抗体拮抗剂(c-Met antibody antagonist)以及小分子c-Met抑制剂。目前发现的小分子c-Met抑制剂绝大多数都是作用在受体酪氨酸激酶的抑制剂。绝大多数化合物都通过与c-Met受体激酶区ATP口袋(ATP binding site)结合，抑制酪氨酸残基的磷酸化，抑制c-Met通路持续异常激活导致的肿瘤细胞异常增殖和生长。 间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）是胰岛素受体酪氨酸激酶家族成员之一。ALK在肿瘤中的异常改变主要是基因移位，异常的移位导致许多ALK融合蛋白（ALK fusion protein）产生，并持续激活ALK，导致肿瘤细胞的异常增殖和生长。同时抑制c-Met和ALK已经证明在胶质母细胞瘤等肿瘤细胞中有协同效应。因此，研究同时作用于c-Met和ALK的双重激酶抑制剂(c-Met/ALK dual inhibitor)是非常有前景的抗肿瘤药物。美国FDA于2011年批准了c-Met/ALK双重抑制剂克唑替尼(Crizotinib)用于治疗有EML4-ALK融合蛋白形成的非小细胞肺癌患者。 虽然c-Met和ALK的双重激酶抑制剂是非常有前景的抗肿瘤策略，但在文献中报道的此类抑制剂很少，除Crizotinib外，还有一个是Xcovery公司研发的X-396，目前在进行一期临床试验。我们实验室多年来一直开展c-Met抑制剂的研究，本论文是在实验室前期的工作基础上，综合文献报道的结果以及临床上应用c-Met/ALK双重抑制剂克唑替尼(Crizotinib)成功的策略，设计和合成新的作用于c-Met和ALK的化合物，旨在发现新的高活性和高选择性的c-Met/ALK双重抑制剂。 主要的实验方法和实验结果 一.SMU系列螺环化合物的设计与合成以及分子对接模拟 在我们实验室之前有关c-Met抑制剂的研发中，发现了一类螺环化合物是有效的高选择性c-Met抑制剂，这些化合物分子中的螺环片段能很好地适应c-Met的ATP结合口袋，而c-Met/ALK双重抑制剂克唑替尼分子中含有典型的激酶铰链区结合基团，即2-氨基吡啶。据此，我们的设计思路是:将螺环片断与激酶铰链区结合基团2-氨基吡啶片断结合成一个新的化合物，可能同时具有c-Met/ALK的双重阻断作用？因此，我们设计了3-位由带手性取代基的苄氧基取代的2-氨基吡啶化合物SMU-A及SMU-B;考虑到2-氨基吡嗪基与2-氨基吡啶基的相似性，又设计了吡嗪化合物SMU-C及SMU-D。上述四个化合物分子中都具有一个手性基团，化学合成难度高。为了减小化学合成的难度，我们除去3-位取代苄氧基中的手性甲基再设计了非手性化合物SMU-E及SMU-F。 然后，我们对设计的化合物与c-Met激酶晶体结构进行了分子对接模拟，发现这些化合物都能与激酶晶体结构进行对接。6个化合物根据Surflex-Dock程序的打分值依次如下:8.68，8.67，9.11，8.95，6.70和6.91，克唑替尼为8.67。以化合物SMU-B为例，c-Met激酶的ATP口袋能够很好地接纳SMU-B，并与其形成多个包括氢键、π-π堆积作用、范德华力等相互作用。在c-Met激酶晶体结构中，SMU-B能与克唑替尼很好地叠合，除了靠近溶剂区的部分，SMU-B与克唑替尼几乎达到完美的重叠一致。此外，SMU-B也能与ALK激酶晶体结构的ATP口袋很好地对接。由此预测，SMU-B应该具有对c-Met和ALK激酶的双重抑制作用。于是，我们合成了六个SMU系列的螺环化合物拟进行下一步的研究。 二.SMU系列螺环化合物对c-Met和ALK激酶高选择性活性的确认 为了验证上述计算机分子模拟的结果，我们首先检测了化合物对细胞中c-Met激酶活性的影响。结果发现，六个化合物对MKN45胃癌细胞中c-Met激酶有显著抑制活性，IC50值依次为0.020，0.019，0.023，0.012，＞10和9.0μM，克唑替尼为0.020μM，与计算机分子对接模拟的预测一致。进一步对上述化合物的生物利用度研究结果表明，SMU-B的口服生物度达到48％，因此确定该化合物进入下一步研究。 首先采用美国KINOMEscanTM公司的激酶高通量筛选技术，评价了SMU-B对人96种蛋白激酶生化活性的影响，发现SMU-B在100nM浓度下仅对c-Met，ALK和AXL三种受体酪氨酸激酶活性有显著的抑制活性，抑制率分别为94.4％，91.2％和95.4％，表明SMU-B对受体酪氨酸激酶家族的c-Met、ALK和AXL三种蛋白激酶表现出高选择性。然后，采用美国Reaction BiologyCorporation的放射蛋白激酶活性检测方法进一步测定了SMU-B对三种激酶生化活性抑制的IC50值。结果表明，SMU-B对c-Met，ALK和AXL三种激酶生化活性都有显著的抑制作用。在激酶底物ATP的存在下，c-Met酶生化活性抑制的IC50值为1.87nM，ALK的IC50值＜0.5nM，AXL的IC50值为28.9nM。SMU-B对三种激酶抑制活性的强度以ALK最强，其次为c-Met，AXL最弱。最后，我们选择c-Met扩增的人胃癌MKN45细胞，ALK激活的人T淋巴瘤Karpas299细胞和AXL高表达的鼠胚胎成纤维MEF细胞来分别评价SMU-B对细胞中c-Met，ALK和AXL三种激酶的抑制活性，结果表明化合物对MKN45细胞c-Met磷酸化抑制的IC50为22nM，对Karpas299淋巴瘤细胞ALK磷酸化抑制的IC50为39nM，对MEF鼠胚胎成纤维细胞AXL磷酸化抑制的IC50为300nM;而阳性化合物克唑替尼对MKN45细胞c-Met磷酸化抑制的IC50为20nM，对Karpas299细胞ALK磷酸化抑制的IC50为110nM，高于SMU-B的39nM。SMU-B对上述三个激酶细胞活性的作用与生化活性结果一致。而SMU-B对AXL细胞磷酸化抑制的IC50为300nM，远高于生化活性的28.9nM，进一步证明了该化合物对AXL激酶活性弱，为高选择性c-Met/ALK双重抑制剂。 三.SMU-B抑制体外培养的c-Met异常的人肿瘤细胞的增殖和生长 我们采用MTT法研究了SMU-B在体外对四种c-Met异常的人肿瘤细胞增殖的影响，发现化合物在体外能显著抑制c-Met扩增的人胃癌GTL-16细胞，c-Met扩增的人肺癌H1993细胞，c-Met高表达人肺癌H441细胞以及有HGF自分泌功能的人脑胶质瘤U87MG细胞的增殖和生长，对GTL-16细胞生长抑制的IC50值为0.020μM，对H1993的IC50值为1.58μM，对H441的IC50值为2.02μM，但对脑胶质瘤U87MG的生长抑制作用较弱，抑制的IC50＞10μM。上述SMU-B在体外抗c-Met异常细胞增殖的筛选结果为下一步体内抗肿瘤实验提供了初步的依据。 四.SMU-B抑制c-Met异常的人GTL-16胃癌，U87MG脑胶质瘤和H441肺癌裸鼠异体移植瘤的生长 根据体外抗增殖作用的结果，我们采用肿瘤异体移植裸鼠模型迸一步评价了SMU-B对c-Met扩增的人胃癌GTL-16细胞，c-Met高表达的人肺癌H441细胞以及有HGF自分泌功能的人脑胶质瘤U87MG细胞的生长抑制作用。结果发现，SUM-B虽然对上述三种c-Met异常的人肿瘤裸鼠异体移植瘤都有显著的抗肿瘤作用，但在裸鼠体内的作用与体外抗增殖结果不完全一致。SMU-B以20mg/kg口服灌胃给药一日一次连续14天，GTL-16胃癌的抑瘤率为56.6％，当剂量增加至40mg/kg时，抑瘤率增加至84.8％;在相同剂量下，对H441的抑瘤率分别为58.9％和78.7％，对U87MG的抑瘤率分别为60.7％和92.3。SMU-B在体外抑制U87MG细胞增殖的IC50值＞10μM，高于GTL-16和H441细胞，但在裸鼠体内的抑瘤作用却比二者好。 五.SMU-B抑制HGF诱导的人肺癌A549细胞的迁移和侵袭作用 由于HGF/c-Met具有增加肿瘤细胞移动和侵袭的能力，我们以外源性HGF诱导c-Met激活的人A549肺癌细胞为模型，研究SMU-B对HGF诱导的A549细胞的迁移和侵袭的影响。A549细胞在正常条件下表达低水平的c-Met，仅在外源性HGF的刺激下c-Met才能被激活发生磷酸化，诱导细胞的移动和迁移。我们的细胞迁移实验结果表明，在无HGF刺激时，A549细胞基本上不发生迁移，但在培养细胞中加入25ng/mL HGF作用48h后，能诱导肿瘤细胞发生移动;在此模型基础上同时加入不同浓度的SMU-B后，能明显抑制肿瘤细胞的移动。此外，细胞侵袭实验结果也表明，在无HGF刺激下，大量A549肿瘤细胞穿过滤膜，表现出明显的侵袭特性，SMU-B能显著抑制HGF诱导的肿瘤细胞的穿膜运动，显示化合物具有抗肿瘤细胞侵袭和迁移的作用。 六.SMU-B在体外能显著抑制外源性HGF诱导的A549肺癌细胞c-Met、AKT及ERK1/2蛋白的磷酸化;也能在体外抑制GTL-16胃癌细胞和在体内抑制GTL-16胃癌裸鼠异体移植瘤的c-Met、AKT和ERK1/2蛋白的磷酸化，通过抑制c-Met信号通路发挥抗肿瘤作用 为了探讨SMU-B对c-Met异常肿瘤产生抗肿瘤作用时，是否同时能抑制c-Met和下游信号分子的激活，我们以外源性HGF激活的A549肺癌和c-Met扩增的GTL-16胃癌细胞模型，研究了化合物对c-Met及其下游介导细胞增殖的信号分子AKT(蛋白激酶B)和介导细胞存活的信号分子ERK1/2(extracellularsignal-regulated kinase)的磷酸化的影响。我们发现，A549细胞在HGF的作用下，c-Met，AKT和ERK1/2的磷酸化明显增加;SMU-B能显著抑制HGF诱导的c-Met、AKT及ERK1/2蛋白的磷酸化。同样，SMU-B也能在体外抑制GTL-16胃癌细胞c-Met的磷酸化以及抑制GTL-16裸鼠异体移植瘤c-Met、AKT以及ERK1/2蛋白的磷酸化。上述结果表明，SMU-B通过抑制裸鼠移植肿瘤的c-Met信号通路发挥抗肿瘤作用。 结论： 1.本文在设计和合成的一系列3-位苄氧基取代的2-氨基吡啶化合物中，首次发现SMU-B对c-Met生化和细胞激酶活性抑制的IC50值分别为1.87nM和22nM，对ALK激酶生化和细胞活性抑制的IC

目录

摘要

前言

第一章 作用于酪氨酸受体激酶c-MET／ALK的新型抗肿瘤化合物的设计与合成

1．1 氨基吡啶基／氨基吡嗪基螺[吲哚啉-3，4’-哌啶]-2-酮类化合物的设计思路

1．2 氨基吡啶基／氨基吡嗪基螺[吲哚啉-3，4’-哌啶]-2-酮类化合物分子对接研究

1．3 氨基吡啶基／氨基吡嗪基螺[吲哚啉-3，4’-哌啶]-2-酮类化合物的合成及生物活性测试

1．4 中间体及SMU类化合物的具体合成方法

1．5 SMU螺环类化合物在BALB／c小鼠体内药代动力学研究

第二章 螺环类化合物SMU-B对蛋白激酶活性的影响

2．1 SMU-B对96种蛋白激酶作用的选择性

2．2 SMU-B对c-Met，ALK和AXL三种激酶生化活性抑制的IC50值

2．3 SMU-B对细胞中三种激酶活性抑制的IC50值

第三章 螺环类化合物SMU-B抑制肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭

3．1 螺环类化合物SMU-B对肿瘤细胞增殖的影响

3．2 SMU-B对肝细胞生长因子诱导的非小细胞肺癌A549细胞迁移的影响

3．3 SMU-B对肝细胞生长因子诱导的非小细胞肺癌A549细胞侵袭的影响

第四章 螺环类化合物SMU-B对人裸鼠移植瘤的生长抑制作用

4．1 实验材料与方法

4．2 实验结果

第五章 螺环类化合物SMU-B抗肿瘤作用的分子机制

5．1 实验材料

5．2 实验方法

5．3 实验结果

讨论

结论

参考文献

缩略词表

攻读博士学位期间参与发表的文章

致谢

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