DPP--4抑制剂西格列汀对动脉粥样硬化的影响及其机制探讨

摘要

背景： 糖尿病(diabetes mellitus，DM)目前已在全球范围内流行，成为发展中国家和发达国家严重危害人类健康和生命的疾病，其主要危害在于慢性并发症的发生。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，糖尿病的发病率日益增加，糖尿病血管并发症的发生率也在逐渐增加，给患者带来了严重的经济和社会负担。糖尿病血管病变包括大血管病变和微血管病变。糖尿病大血管病变包括脑血管疾病、冠心病（coronary heart disease，CHD）和周围血管疾病;糖尿病微血管病变包括糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)，糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy，DR)和糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)。糖尿病大血管并发症是导致2型糖尿病患者死亡的主要原因，而动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)则是其最主要的病理特征，动脉粥样硬化是一种常见的以慢性炎症反应为主要特征的血管疾病，主要累及大中型血管动脉内膜，血管内皮受损为其起始环节，继而引起血脂沉积，单核细胞聚集，泡沫细胞形成，平滑肌细胞增生和血管内皮细胞功能紊乱，最终导致动脉粥样硬化病变的形成。鉴于糖尿病大血管病变的发生率日益增加及其可能带来的严重危害，如何预防糖尿病大血管病变已经成为全球共同关注的重要问题，然而糖尿病大血管病变的发病机制至今仍不十分清楚，因此也给治疗方案的选择带来了一定的困难。 二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制剂是一种新型的口服降糖药物，主要是通过选择性抑制DPP-4的活性，阻止胰高血糖素样肽-1(glucagonlike peptide-1，GLP-1)降解失活，增加血清中活性GLP-1的水平以及延长GLP-1的作用时间来增加其生理作用，从而发挥降低血糖的作用，DPP-4抑制剂除了可以降低糖基化血红蛋白(glycoseylated hemoglobin，HbA1C)，空腹血糖(fastingblood glucose，FBG)和餐后血糖(postprandial blood glucose，PBG)的水平之外，还能促进胰岛β细胞分泌胰岛素并抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素，从而改善胰岛细胞功能紊乱，并且不增加体重和低血糖等不良反应的发生率。GLP-1是由人胰高血糖素基因编码，小肠L细胞分泌的一种肽类激素，在食物中营养物质的刺激下分泌并释放入血液，从而发挥其生理作用。GLP-1以葡萄糖依赖方式作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录，增加胰岛素的生物合成和分泌，同时刺激胰岛β细胞的增殖和分化，抑制β细胞凋亡，增加β细胞数量，改善β细胞功能，并抑制α细胞分泌胰高血糖素，从而发挥降低糖化血红蛋白、空腹血糖和餐后血糖的作用;此外GLP-1还可抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空以及降低体重。然而内源性GLP-1的半衰期很短，极易被体内的DPP-4降解而失活，DPP-4又称T细胞表面抗原CD26，是一种细胞表面的丝氨酸蛋白酶，部分以可溶形式存在于循环血液中，其主要酶活性作用是优先将氨基末端第2个氨基酸寡肽的氨基末端前两个氨基酸剪切去除，而天然GLP-1的氨基末端第二个氨基酸可被DPP-4剪切成为截断的GLP-1，失去促胰岛素分泌活性，该失活作用快速且不可逆。目前大量研究证实GLP-1受体激动剂可以延缓动脉粥样硬化的发生发展，作用机制可能与GLP-1类似物作用于GLP-1受体(glucagon like peptide-1 receptor，GLP-1R)之后，激活环磷酸腺苷/蛋白激酶A（cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A，cAMP/PKA）信号通路，与改善炎症反应和血管内皮功能等作用相关。而西格列汀作为一种竞争性DPP-4抑制剂，可与DPP-4高保守的β螺旋区谷氨酸盐残基非共价结合，抑制DPP-4的活性，通过增加生理性GLP-1的活性和作用时间从而发挥降糖作用，有研究报道显示它除了具有降低血糖的作用之外，还可能在心血管疾病方面存在保护作用。近年来有研究提示西格列汀可能延缓动脉粥样硬化的发展，但具体作用机制很复杂且目前尚不清楚。有些研究推断可能也是通过作用于GLP-1R后激活cAMP/PKA信号通路，发挥心血管保护作用有关;但也有些研究认为西格列汀可能通过增加一氧化氮等途径来起到保护血管内皮的作用，并不依赖于cAMP/PKA或者是PI3K/Akt信号通路。研究证实AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)信号通路都可能参与了动脉粥样硬化形成的机制调节过程。AMPK作为生物代谢能量调节的重要分子，表达于各种代谢相关的器官中，研究发现它的活化具有抗动脉粥样硬化的作用，主要通过上调Akt/eNOS信号通路，从而抑制p38介导的核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)活化过程，继而减轻炎症反应;而MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，MAPK信号通路主要包括p38、细胞外信号调控的蛋白激酶(extracellularsignal-regulated kinase mediates，Erk)以及c-Jun N端激酶(c-jun amino-terminalkinase，JNK)/应激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)等途径，是细胞将信号从细胞外传递到细胞内的主要通路，研究证实其在抑制后可能通过抑制粘附分子的表达、抗炎症作用以及增加粥样斑块的稳定性，从而对动脉粥样硬化疾病起到保护作用。 虽然目前关于糖尿病大血管并发症的发病机制仍不清楚，但多认为与以下五个方面有关，即蛋白激酶C(protein kinse C，PKC)的活化、蛋白质非酶促糖基化、氧化应激、多元醇通路异常和己糖胺途径异常，其中慢性高血糖所诱导的血管组织PKC活化被认为是最重要的机制之一。PKC作为一种重要的蛋白激酶，广泛存在于人体各种组织和细胞中，属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，它不是单一分子的酶，而是一组相互之间密切相关、有多种亚型的蛋白质家族，可作用于多种信号转导通路，使细胞内多种蛋白质磷酸化，从而调控细胞生长、增殖、衰老、凋亡等一系列生理生化过程。目前已经发现PKC包括经典型、新型和非典型三大类，共11种亚型。经典型又称cPKC，包括PKCα、β(ⅠⅡ)和γ，可被钙离子、二脂酰甘油和佛波酯激活;新型又称nPKC，包括PKCδ、ε、η和θ，可被二脂酰甘油和佛波酯激活;非典型又称aPKC，包括PKCζ和λ，一般是被磷脂类物质所激活，其激活不依赖于钙离子、二脂酰甘油或佛波酯。PKC的分布具有亚型特异性，心血管组织中有多种PKC亚型表达如PKCα、PKCβ、PKCδ、PKCε、PKCζ等，β亚型主要分布在心血管组织，故研究最多。多种因素可诱导PKC的活化，但高血糖是最重要的诱导因素，在糖尿病高血糖状态下，中间代谢产物糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、细胞因子和生长因子等均可使二脂酰甘油的从头合成增加，进而激活PKC。既往研究提示PKCβ活化可能促进动脉粥样硬化的发生，但机制仍不清楚，且目前关于西格列汀与PKCβ之间可能存在的关系国内外尚无相关报道。 针对本领域存在的上述问题，我们对本课题研究进行设计，首先以动脉粥样硬化的经典模型载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein Eknockout mice，ApoE-/-)小鼠作为研究对象，探讨新型降糖药物西格列汀是否具有独立于降糖作用之外的心血管保护作用以及可能存在的作用机制;同时将血管内皮细胞特异性PKCβ过表达转基因小鼠(vascular endothelial-specific PKCβ over-expressiontransgenic mice，VEPKCβ+/-)与ApoE-/-小鼠进行杂交后，制备出血糖正常的以ApoE-/-为背景的PKCβ转基因动物模型(VEPKCβ+/-ApoE-/-)作为研究对象，观察血管内皮特异性PKCβ过表达对动脉粥样硬化病变的影响，并对该模型给予西格列汀干预，观察西格列汀是否可延缓该动物模型动脉粥样硬化的发生发展，同时探讨可能存在的作用机制，为西格列汀预防2型糖尿病大血管并发症的临床应用提供更多的理论依据。本文从以下几部分进行了论述。 第一部分 DPP-4抑制剂西格列汀对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响及其机制研究 目的： 1、观察DPP-4抑制剂西格列汀对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响。 2、探讨西格列汀延缓动脉粥样硬化形成的机制是否与激活AMPK和抑制MAPK信号通路有关。 方法： 1、将24只8周龄的雄性ApoE-/-小鼠作为实验对象，分为两组，每组12只，分别给予高脂（含21.8％脂肪和1.25％胆固醇）饮食和高脂混合西格列汀(0.3％w/w)饮食，各喂养16周。 2、实验分组: 第1组:对照组，8周龄雄性ApoE-/-小鼠共12只，喂养高脂饲料共16w; 第2组:西格列汀组，8周龄雄性ApoE-/-小鼠共12只，喂养高脂混合西格列汀饲料(0.3 w/w)共16w; 3、每周记录小鼠体重和进食量，14周时禁食16h后腹腔注射20％葡萄糖注射液(1g/kg)后分别测0min，15min，30min，60min和120min时小鼠尾静脉的血糖水平。 4、喂养16周后，禁食8h后腹腔注射1.5％戊巴比妥钠(5ul/g)，小鼠麻醉后摘眼球取血，室温静置30min后，离心3000rpm，10min，取血清，-80度冻存，分别用ELISA方法和全自动生化检测仪检测血清中血脂谱水平和可溶性粘附分子的表达水平。 5、取血后采用脊椎脱臼法处死小鼠，解剖并分离出小鼠主动脉至腹主动脉分叉处，往小鼠左心室内注入0.9％生理盐水，冲洗主动脉，在解剖显微镜下由下而上剖开后再滤纸上铺开，用4％福尔马林固定液固定36h后，苏丹Ⅳ染液染色10min后放入70％乙醇溶液中分化10min，再用清水漂洗20min，放入两片载玻片中，在解剖显微镜下用相机拍照。 6、小鼠主动脉分离后用4％福尔马林固定液固定24h，采用石蜡切片的方法将主动脉制成平片后分别用Masson特殊染色法和免疫组化的方法检测主动脉斑块中胶原纤维、巨噬细胞和平滑肌细胞的表达水平;小鼠主动脉分离后放入-80度冻存，部分组织提取蛋白后采用免疫印迹法方法检测主动脉组织中AMPK（AMPK和Akt）和MAPK（p38和Erk1/2）信号通路磷酸化蛋白与总蛋白的表达情况;部分组织提取RNA后采用RT-PCR的方法检测主动脉中DPP4和GLP-1R以及MCP-1和IL-1等炎症因子的表达情况。 5、统计学处理:实验数据采用SPSS13.0进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差((x)±s)表示，两独立样本数据采用不配对的t检验进行比较，P＜0.05认为差异具有统计学意义。 结果： 1.两组间各代谢指标水平的比较: 小鼠体重和进食量水平在两组间比较无显著性差异;腹腔糖耐量实验结果显示两组间的血糖水平在0min、15min、30min、60min和120min五个时间点均无显著性差异;与对照组相比，西格列汀可升高血清中高密度脂蛋白(HDL)的水平(52.78±5.25 vs97.76±8.56，P＜0.001)，但血清中甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)的表达水平在两组间比较无显著性

目录

摘要

前言

第一章 DPP-4抑制剂西格列汀对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响及其机制研究

第1节 实验材料

第2节 实验方法及步骤

第3节 实验结果

讨论

第二章 DPP-4抑制剂西格列汀对血管内皮特异性PKCβ2过表达的ApoE基因敲除(VEPKCβ2+／-ApoE-／-)小鼠动脉粥样硬化的影响及机制初探

第1节 实验材料

第2节 实验方法及步骤

第3节 结果

讨论

小结

参考文献

英文缩略词表

攻读学位期间科研成果

致谢

声明

统计学证明