ASIC3在应激性急性胃粘膜病变中的作用及舒芬太尼预先给药对其的影响

摘要

背景与目的： 尽管已经研究了近70年，急性胃粘膜病变(AGML)至今仍是危重病学领域面临的重大难题之一。作为应激反应的一个非特异表现，AGML的发生机制是多因素、多水平共同作用的结果，涉及到胃组织及肠神经系统层面、感觉传入神经、中枢神经系统三个解剖层面，伤害性应激可通过神经、内分泌、免疫等多种途径作用于这三个层面，从而引起AGML。近年来，一些离子通道和受体作为酸感受器、伤害性感受器对胃肠道伤害性应激的调控作用日益受到重视，在这些感受器中，酸敏感离子通道3(ASIC3)是目前的研究热点之一。 前期研究表明，ASIC3作为酸感受器、伤害感受器在胃肠道信息处理过程中起重要作用。在实验大鼠中，投射胃的82％的DRG神经元有表达ASIC3。而在人的胃肠道中，在炎性肠病中ASIC3在肠粘膜上表达增加，在过敏性紫癜所致胃肠功能紊乱人群的胃粘膜上ASIC3也呈高表达性。但迄今为止，尚未有研究证实ASIC3在实验大鼠胃组织层面的表达情况;也没有研究系统阐述ASIC3在浸水束缚应激（WIRS）致AGML大鼠模型中胃组织层面、感觉传入神经通路、中枢神经系统三个解剖层面的时空分布模式;尚未有研究通过给予ASIC3特异性拮抗剂明确其在AGML的作用机制。故此，本研究拟通过建立WIRS致AGML模型，重点分析ASIC3在胃组织层面、感觉传入神经通路、中枢神经系统三个解剖层面的时空分布模式，并给予ASIC3特异性拮抗剂，明确其在AGML的作用机制，进一步阑明舒芬太尼对AGML的保护机制，旨在较全面的获取ASIC3参与和调控AGML形成的可靠证据，为确立ASIC3作为AGML防治的新靶点提供科学依据，也为围术期应激控制防治AGML的发生奠定坚实的基础。 方法 成年雄性SPF级Wistar大鼠（南方医科大学实验动物中心提供），随机分成6组:浸水束缚应激0小时组（WIRS0h组）或正常对照组(NC组)，浸水束缚应激2小时组(WIRS2h组)，浸水束缚应激应激4小时组(WIRS4h组)，浸水束缚应激6小时组(WIRS6h组)，舒芬太尼预先给药+浸水束缚应激6小时组(Sufen组)，Toxin APETx2预先给药+浸水束缚应激6小时组（AT组）。采用浸水束缚应激法复制应激性胃粘膜损伤模型，分别于各对应时间点取出胃测定胃液pH值;胃组织MDA、SOD总活力;HE染色观察胃组织病理学改变;免疫组化染色及Westblot法检测ASIC3蛋白在胃组织、DRG神经元及下丘脑室旁核的染色定位及表达量;实时定量PCR法测定ASIC3 mRNA在胃组织、DRG神经元及下丘脑的相对表达量。根据预实验及既往研究确定观测样本量，其中胃液pH值、HE染色、UI计数取8-10个样本，免疫组化染色及MDA、SOD总活力检测取6个样本，qPCR及Westblot法检测取4个样本。 结果： 1.各组大鼠胃内pH值的变化 与WIRS0h组比较，余各时间段WIRS组的pH值均显著下降（P＜0.05）;WIRS2h组、WIRS4h组及WIRS6h组组间比较无统计学意义（P＞0.05），但WIRS4h组pH值略有回升。 2.胃组织病理学检查 光镜下WIRS0h组(NC组)胃粘膜结构正常，层次清楚。WIRS2h组:光镜下胃粘膜部分肿胀，胃粘膜少许溃疡灶，腺体间隙扩大，偶见部分溃疡灶点状出血。WIRS4h组:光镜观察可见胃粘膜水肿充血，有溃疡形成，表层粘膜部分坏死脱落，基底部可见部分胃腺组织缺失。WIRS6h组:大鼠胃粘膜大片状脱落及胃粘膜上皮细胞坏死，粘膜层有广泛的坏死组织及红细胞和大量的炎症细胞渗出，嗜酸性细胞、淋巴细胞浸润于粘膜固有层，粘膜连续性中断并形成火山口状溃疡，溃疡甚至深达至肌层，出血明显。Sufen组:镜下可见胃粘膜肿胀，胃粘膜少许溃疡灶，腺体间隙扩大，表层上皮见小片状脱落，下层粘膜微循环淤滞，毛细血管充血于细胞间质，粘膜固有层局限损伤，未达肌层。AT组:受损粘膜较表浅局限，出血坏死较少，胃粘膜完整性较好，局部仍有单层柱状上皮细胞肿胀或缺如，粘膜下层毛细血管仍有血流淤滞现象。 3.大鼠胃组织SOD、MDA检测 与WIRS0h组(NC组)比较，其余各WIRS组、Sufen组及AT组的的SOD值均显著下降(P＜0.05)，且MDA值均明显升高（P＜0.05）;随着WIRS时间的延长，SOD值的下降趋势及MDA值的上升趋势均明显，且组间比较有统计学意义(P＜0.05)。与WIRS6h组比较，Sufen组及AT组的的SOD值均明显升高(P＜0.05)，且MDA值均显著下降（P＜0.05）;与Sufen组比较，AT组的SOD值及MDA值表达变化均无统计学意义(P＞0.05)。 4.ASIC3免疫组化表达与定位 WIRS0h组(NC组)胃组织ASIC3仅微弱阳性表达，偶见于粘膜上皮细胞层;WIRS2h组即可见全层胃粘膜呈棕黄色强阳性表达，主要分布于粘膜上皮细胞层、胃腺主细胞及壁细胞;WIRS4h组不仅可见全层胃粘膜呈棕黄色强阳性表达，粘膜下神经丛也呈阳性表达;WIRS6h组上皮细胞层破坏明显，棕黄色强阳性表达主要定位于胃腺主细胞及壁细胞、粘膜下神经丛和胃肌层神经丛。Sufen组也有阳性表达，主要分布于上皮细胞层、胃腺主细胞及壁细胞、粘膜下神经丛和胃肌层神经丛;AT组胃组织ASIC3呈弱阳性表达，仅在胃粘膜层表达。 各组DRG神经元ASIC3免疫组化染色定位于神经元细胞上。WIRS0h组DRG神经元细胞上可见ASIC3仅微弱阳性表达;其余各WIRS组ASIC3在DRG神经元细胞上呈棕黄色强阳性表达，其中以WIRS4h组棕黄色强阳性表达最明显。 下丘脑PVN神经元ASIC3蛋白免疫组化染色结果:各组PVN神经元ASIC3蛋白免疫组化染色定位于神经元细胞膜及细胞浆。NC组可见大量棕黄色细胞染色;WIRS2h组及WIRS4h组仅见少量神经元细胞呈黄色染色;WIRS6h组、Sufen组及AT组神经元细胞棕黄色阳性表达细胞显著增多。 5.ASIC3蛋白表达变化结果 与WIRS0h组(NC组)比较，其余各WIRS组、、Sufen组及AT组的ASIC3蛋白灰度值均显著升高（P＜0.05）;与WIRS2h组比较，WIRS4h组及WIRS6h组的ASIC3蛋白灰度值均显著升高(P＜0.05);与WIRS4h组比较，WIRS6h组的ASIC3蛋白灰度值呈下降趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。与WIRS6h组比较，AT组的ASIC3蛋白灰度值显著下降(P＜0.05)，Sufen组的ASIC3蛋白灰度值略有下降，但差异无统计学意义(P＞0.05)。 各组大鼠DRG神经元ASIC3蛋白Western blot结果如图1-12、1-13，表1-6所示，与WIRS0h组比较，其余各WIRS组的ASIC3蛋白灰度值均显著升高(P＜0.05);与WIRS2h组比较，WIRS4h组及WIRS6h组的ASIC3蛋白灰度值均显著降低（P＜0.05）;与WIRS4h组比较，WIRS6h组的ASIC3蛋白灰度值表现为下降，且有统计学意义(P＜0.05)。 6.ASIC3 mRNA荧光定量表达结果 与WIRS0h组(NC组)比较，其余各WIRS组、Sufen组及AT组的的ASIC3 mRNA表达量均显著升高（P＜0.05）;与WIRS2h组比较， WIRS4h组及WIRS6h组的ASIC3 mRNA表达量均显著升高（P＜0.05）;与WIRS4h组比较，WIRS6h组的ASIC3 mRNA表达量表现为下降，且有统计学意义(P＜0.05)。与WIRS6h组比较，AT组的ASIC3 mRNA表达量显著下降(P＜0.05)，Sufen组的ASIC3 mRNA表达量下降不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)。 各组大鼠DRG神经元ASIC3 mRNA荧光定量表达结果:与WIRS0h组比较，其余各WIRS组的ASIC3 mRNA表达量均显著升高（P＜0.05）;与WIRS2h组比较， WIRS4h组及WIRS6h组的ASIC3 mRNA表达量均显著升高(P＜0.05);与WIRS4h组比较，WIRS6h组的ASIC3 mRNA表达量表现为下降，且有统计学意义(P＜0.05)。 各组大鼠下丘脑ASIC3 mRNA荧光定量表达结果:与NC组比较，其余各实验组的ASIC3 mRNA表达量均显著降低（P＜0.05）;与WIRS2h组比较，WIRS4h组、WIRS6h组、Sufen组及AT组ASIC3 mRNA表达量均显著升高(P＜0.05);与WIRS4h组比较，WIRS6h组、Sufen组及AT组ASIC3 mRNA表达量均显著升高（P＜0.05）;与WIRS6h组比较， Sufen组及AT组ASIC3 mRNA表达量均显著升高（P＜0.05）;与Sufen组比较，AT组ASIC3 mRNA表达量无显著变化（P＞0.05）。 7.下丘脑PVN神经元c-fos蛋白免疫组化染色结果 各组PVN神经元c-fos蛋白免疫组化染色定位于神经元细胞核上，c-fos免疫阳性细胞核呈深褐色，c-fos免疫阴性细胞核呈浅蓝色。NC组可见极少量褐色细胞核染色;WIRS2h组神经元细胞可见大量深褐色细胞核染色;WIRS4h组及WIRS6h组均可见中量的神经元深褐色细胞核染色;Sufen组及AT组可见少量的神经元深褐色细胞核染色。 8.各指标间相关性分析 ASIC3在胃组织及DRG神经元中的表达与胃内PH值及胃组织SOD值呈显著负相关，与胃组织MDA值呈显著正相关;胃组织ASIC3表达量与DRG神经元ASIC3表达量呈显著正相关。 下丘脑ASIC3 mRNA表达及PVN ASIC3免疫阳性细胞数与PVN c-fos蛋白免疫阳性细胞数呈显著负相关。 结论： 1.WIRS时间与胃粘膜损伤程度密切相关，随着WIRS时间延长，胃粘膜损伤进行性加重，在AGML发展过程中，胃液的持续性酸化，胃组织氧化性损伤加重，抗氧化能力减弱是AGML进行性加重的重要因素。为复制严重出血性坏死性急性胃粘膜损伤模型，应至少给予大鼠6小时的浸水束缚应激。 2.本研究首次系统阑述了ASIC3在胃组织的表达情况:ASIC3微弱阳性表达于大鼠胃组织中，WIRS2h即可使ASIC3在全层胃粘膜呈阳性表达;WIRS4h不仅可见ASIC3在全层胃粘膜强阳性表达，粘膜下神经丛也呈阳性表达;WIRS6h ASIC3的棕黄色强阳性表达主要定位于胃腺主细胞及壁细胞、粘膜下神经丛和胃肌层神经丛。 3.本研究系统阑述了ASIC3在大鼠投射胃的DRG神经元的表达情况:ASIC3可呈微弱阳性表达于神经元细胞上，WIRS可使这些DRG神经元上ASIC3呈高表达性，其中以WIRS4h时ASIC3的强阳性表达最明显。WIRS6h时ASIC3的阳性表达已较WIRS4h显著下降，但仍显著高于正常状态。 4.本研究系统阑述了ASIC3在下丘脑室旁核神经元的表达情况及对神经元活动的影响:ASIC3高表达于正常大鼠的下丘脑中，ASIC3免疫阳性细胞广泛分布于PVN中。大鼠浸水束缚可使下丘脑ASIC3 mRNA表达量减少，抑制ASIC3蛋白在PVN神经元的高表达，且其变化趋势与c-fos蛋白表达量显著负相关，提示WIRS时下丘脑ASIC3的变化可能与其神经元的电活动有关。 5.通过腹腔内给予ASIC3特异性拮抗剂APETx2预先给药，首次证实APETx2通过下调胃组织ASIC3的表达，并通过抗氧自由基作用起胃粘膜保护作用。确证了胃组织ASIC3是调控伤害性应激的关键性因子。由于下丘脑ASIC3的作用机制尚未清楚，ASIC3在中枢层面对WIRS的调控作用尚需进一步研究。 6.通过腹腔内给予舒芬太尼预先给药，

目录

摘要

前言

第一部分 不同时间浸水束缚应激对大鼠胃组织及DRG神经元ASIC3表达的影响

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方案

1．3 观察指标与测定方法

2 结果

2．1 各组大鼠胃内pH值的变化

2．2 胃组织病理学检查

2．3 大鼠胃组织SOD、MDA检测

2．4 ASIC3免疫组化表达与定位

2．5 ASIC3蛋白表达变化结果

2．6 ASIC3 mRNA荧光定量表达结果

2．7 各指标间相关性分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 舒芬太尼预处理对浸水束缚应激大鼠胃组织ASIC3表达的影响

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 实验方案

1．3 观察指标与测定方法

2 结果

2．1 大鼠一般情况变化比较

2．2 大鼠肉眼下胃粘膜形态学比较

2．3 大鼠胃粘膜损伤溃疡指数(UI)比较

2．4 胃组织病理学检查

2．5 大鼠胃组织SOD、MDA的测定

2．6 胃组织ASIC3免疫组化表达结果

2．7 胃组织ASIC3蛋白表达结果

2．8 胃组织ASIC3 mRNA表达结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 不同时间WIRS对室旁核神经元活动及ASIC3表达的影响及舒芬太尼对其的作用

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 实验方案

1．3 观察指标与测定方法

2 结果

2．1 下丘脑ASIC3 mRNA荧光定量表达结果

2．2 下丘脑PvN神经元ASIC3蛋白免疫组化染色结果

2．3 下丘脑PVN神经元c-fos蛋白免疫组化染色结果

2．4 各指标间相关性分析

3．讨论

4．小结

参考文献

全文结论

综述

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明