淀粉样前体蛋白在卵巢颗粒细胞和卵泡液中的表达以及与多囊卵巢综合征的关系

摘要

随着时代的发展，生活方式的改变，现代女性由于教育、工作等多种原因而选择延迟初次生育时间的趋势越来越明显，导致许多年龄相关性不孕。大多数女性在30岁之后，卵巢开始衰老，储备功能逐渐降低，随着年龄增长生育力继续下降，因此年龄成为影响女性生育能力最重要的因素。 卵巢衰老是机体衰退的一部分，引起其它组织器官衰老的因素也可能参与卵巢的衰老。阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是中枢神经系统退行性疾病，也是一种年龄相关性疾病。目前认为淀粉样前体蛋白(Amyloid precursorprotein，APP)是AD发病机制的关键环节。APP是一个跨膜蛋白，在机体多种细胞表达，本身具有多种生物学功能。它经不同分泌酶作用有两条分解途经，由α-分泌酶分解产生可溶性APPα(sAPPα)，后者已被证实能促进多种细胞的增殖，发挥类似生长因子的功能。APP经β-分泌酶途径产生sAPPβ和Aβ，Aβ聚集后产生毒性是AD发病的核心。Aβ可作用于多种细胞表面受体经过一系列级联反应，最终可引发细胞凋亡。APP及其分解产物在神经系统的作用已有深入研究，但在生殖系统尚无研究报道。 多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome，PCOS)是育龄期妇女常见的内分泌紊乱性疾病，是卵巢无排卵性不孕最常见原因，有着多种血清激素的特征性改变和多种代谢异常。PCOS患者体内（包括卵巢组织）氧化应激水平增加，有学者发现PCOS患者血清AGEs水平增高，颗粒细胞上AGEs受体(RAGE)表达也增加。晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)是体内还原糖的醛基与非酶类蛋白质、脂质或核酸发生非酶糖化反应形成的代谢副产物，被认为是氧化应激状态的一个潜在强诱导剂，AGEs-RAGE可能通过增加ROS的产生，增加氧化应激状态，参与PCOS的发生。RAGE有多种配体，而APP分解产物Aβ也是其中之一，RAGE在Aβ介导的氧化损伤中扮演重要角色。在神经系统的研究显示Aβ可以作用于细胞表面的RAGE通过激活NF-kB信号通路产生氧化应激。 本研究通过检测卵巢颗粒细胞中APPmRNA及蛋白水平的表达情况，检测其分解产物sAPPα和sAPPβ在卵泡液中的水平，验证APP、sAPP在卵巢中的表达，初步探讨它在女性生殖系统可能发挥的作用;并比较APP和RAGE mRNA在PCOS患者颗粒细胞中的表达以及卵泡液中sAPP和AGEs的水平，初步探讨APP、AGEs-RAGE与PCOS间可能存在的关系。 第一部分卵巢颗粒细胞和卵泡液中淀粉样前体蛋白及其分解产物表达情况 [研究目的] 检测淀粉样前体蛋白(APP)及其分解产物sAPPα和sAPPβ在经IVF/ICSI治疗的不孕症妇女卵巢颗粒细胞(GC)和卵泡液(FF)中的水平，证实卵巢中存在APP及sAPP的表达，探讨其表达情况与妇女生育年龄的关系。 [研究方法] 1、本研究经南方医院伦理委员会批准，标本收集经患者知情同意。选择2013年1月至2014年1月在南方医院生殖中心因输卵管性因素或（和）男性因素接受体外受精/卵母细胞浆内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治疗的不孕症患者106例。所有患者采用黄体中期降调节长方案促排卵，后行经阴道取卵术，收集颗粒细胞(GC)及第一个穿刺卵泡的卵泡液(FF)。 2、用Percoll分离法收集颗粒细胞。Trizol法提取总RNA并逆转录为cDNA，后行APP基因实时荧光定量PCR(real-time PCR)，采用△△Ct法计算APPmRNA相对表达量。RIPA法提取颗粒细胞总蛋白，后行蛋白免疫印迹法(western blot)测定颗粒细胞APP的相对表达量。FF收集后离心留取上清，用酶联免疫吸附方法(ELISA)测定卵泡液中sAPPα和sAPPβ水平。 3、将纳入研究的106例患者按年龄35岁为界分为两组，年龄＜35y组50例，≥35y组56例，比较组间各临床指标、APPmRNA、蛋白及sAPPα和sAPPβ的表达水平，并进行相关性分析。 4、采用SPSS16.0统计软件进行数据统计分析，对计量资料进行正态性检验，服从正态分布者组间比较采用t检验;直线相关性分析采用Pearson相关分析。非正态分布数据采用秩和(wilcoxon)检验、相关分析采用Spearman相关分析。结果用均数±标准差（(x)±s）表示。设置双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 [研究结果] 1、在所有研究对象颗粒细胞上均检测到APPmRNA、蛋白的表达，在所有卵泡液中均检测到两种sAPP。 2、年龄≥35y组患者卵巢颗粒细胞APPmRNA、蛋白平均相对表达量均高于年龄＜35y组，分别为:(4.56±3.37 VS2.98±2.09，P=0.008;2.51±1.54 VS1.15±0.68，P=0.000)，差异有统计学意义。 3、颗粒细胞APP蛋白相对表达量与年龄(r=0.506，P=0.000)、bFSH(r=0.239，P=0.021)、Gn使用总量（r=0.216， P=0.038）呈显著正相关关系;与AFC(r=-0.268，P=0.009)、抽吸卵泡数(r=-0.256，P=0.013)、获卵数(r=-0.2339，P=0.025)呈显著负相关关系。 4、年龄＜35y组卵泡液中sAPPα水平高于≥35y组(172.22±38.02 vs162.44±47.23 ng/ml)，但差异无统计学意义(P=0.247)。而≥35y组卵泡液中 sAPPβ水平较＜35y组显著升高(143.82±30.40 vs128.70±36.83 ng/ml)，差异有统计学意义(P=0.024)。卵泡液sAPPβ水平与年龄呈显著正相关关系(r=0.258，P=0.008)，与AFC、HCG日E2水平呈显著负相关关系(r=-0.235，P=0.016;r=-0.216，P=0.028);卵泡液中sAPPα水平与获卵数呈显著正相关关系(r=0.236，P=0.015)。 [研究结论] 1、本研究首次检测淀粉样前体蛋白(APP)及其分解产物APPα和sAPPβ在人卵巢颗粒细胞及卵泡液的表达。证实了APP存在于人卵巢组织中。 2、颗粒细胞上APP蛋白相对表达量与患者年龄、血清基础FSH水平、Gn使用总量呈正相关关系，与窦状卵泡数、获卵数、成熟卵子数呈负相关关系，提示APP可能与卵巢衰老有关。 3、卵泡液中均检测到两种sAPP，证实卵泡微环境中存在sAPP。sAPPβ水平与年龄呈正相关关系，与AFC、HCG日E2水平呈负相关关系;sAPPα水平获卵数呈正相关关系。 4、本研究检测了APP及sAPP在卵巢颗粒细胞和卵泡液中的表达，但是对于它们在女性生殖系统的作用尚属于推测，未做机制研究证实。 第二部分淀粉样前体蛋白与糖基化终产物在多囊卵巢综合征患者颗粒细胞及卵泡液的表达 [研究目的] 研究经IVF治疗的多囊卵巢综合征(PCOS)不孕症患者颗粒细胞上淀粉样前体蛋白(APP)与晚期糖基化终产物受体(RAGE)的表达情况，检测卵泡液中sAPPα、sAPPβ和晚期糖基化终产物(AGEs)的水平，初步探讨APP、AGEs-RAGE与多囊卵巢综合征的关系。 [研究方法] 1、选择2013年7月到2014年1月在南方医院生殖中心诊断PCOS的（25例）患者为研究组，选择因单纯输卵管因素行IVF治疗的患者（30例）为对照组。PCOS诊断参照2003年欧洲人类生殖和胚胎学会与美国生殖医学学会（ESHRE/ASRM）议定的鹿特丹标准。比较两组间各临床指标、各检测指标表达的水平。 2、所有患者经促排卵后行经阴道取卵术，收集及颗粒细胞(GC)及第一个穿刺卵泡的卵泡液(FF)。用Percoll分离法收集颗粒细胞。Trizol法提取总RNA并逆转录为cDNA，后行APP、RAGE基因实时荧光定量PCR(real-timeqPCR)，采用△△Ct法分别计算APPmRNA、RAGEmRNA的相对表达量。RIPA法提取颗粒细胞总蛋白，后行western blot测定颗粒细胞APP的相对表达量。FF收集后离心留取上清，用ELISA方法测定卵泡液中sAPPα、sAPPβ和AGEs水平。 3、采用SPSS16.0统计软件进行数据统计分析，对计量资料进行正态性检验，服从正态分布者组间比较采用t检验;直线相关性分析采用Pearson相关分析。非正态分布数据采用秩和(wilcoxon)检验、相关分析采用Spearman相关分析。结果用均数±标准差（(x)±s）表示。设置双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 [研究结果] 1、 PCOS组患者血清基础卵泡刺激素(bFSH)低于对照组;窦状卵泡数(AFC)、血清基础黄体生成素(bLH)、bLH/bFSH值、血清基础总睾酮(TT)、平均月经周期（天）均高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。 2、 PCOS组患者卵巢颗粒细胞APPmRNA相对表达量高于同年龄对照组，但差异无统计学差异(4.20±2.61 vs3.03±2.42，P=0.090);蛋白相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（1.63±0.93 vs1.08±0.69，P=0.021）。 3、 PCOS组患者卵泡液sAPPα水平高于对照组(179.11±31.58 vs167.35±36.87 ng/ml)，差异无统计学意义(P=0.215)。卵泡液sAPPβ水平显著高于对照组(143.96±25.60 vs126.31±33.37 ng/ml)，差异有统计学意义(P=0.035)。PCOS组患者卵泡液sAPPβ水平与血清基础LH水平呈显著正相关关系(r=0.413，P=0.040)。 4、 PCOS组患者卵泡液AGEs水平高于对照组(1.31±0.56 vs1.11±0.66ng/ml)差异无统计学意义(P=0.137);PCOS组患者颗粒细胞RAGE mRNA相对表达量高于对照组(2.16±1.02 vs1.07±0.99)，差异有统计学意义(P=0.026)。 [研究结论] 1、 PCOS患者颗粒细胞APP蛋白相对表达量及卵泡液中sAPPβ水平显著高于同年龄段非PCOS患者，提示APP经淀粉生成途径分解增加，APP及sAPP可能参与PCOS的疾病过程。 2、 PCOS患者颗粒细胞RAGE mRNA表达量显著高于同年龄段非PCOS患者，其卵泡液AGEs水平亦有升高趋势。提示PCOS患者卵巢局部氧化应激增加。 3、本研究检测了APP及sAPP在PCOS患者卵巢颗粒细胞和卵泡液中的表达，检测了颗粒细胞RAGE mRNA和卵泡液AGEs水平，但是对于它们的相互作用以及对PCOS的影响属于推测，尚需进一步机制研究以证实。

目录

摘要

前言

第一部分 卵巢颗粒细胞和卵泡液中淀粉样前体蛋白及其分解产物表达情况

前言

材料与方法

实验结果与分析

讨论

结论

第二部分 淀粉样前体蛋白与糖基化终产物在多囊卵巢综合征患者颗粒细胞及卵泡液的表达

前言

材料与方法

实验结果与分析

讨论

结论

参考文献

主要中英文缩写词对照表

攻读学位期间成果

致谢

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