多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞PPARγ、P450arom表达及与IVF-ET结局关系研究

摘要

目的：
　　 多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是育龄期妇女常见的一种生殖内分泌疾病，严重影响了女性的生殖能力，在女性不孕中，不排卵因素占30％-40％，PCOS占无排卵性不孕症的50％-70％。PCOS临床表现具有高度异质性，主要有:月经稀发或闭经、肥胖、多毛、痤疮、黑棘皮症等。PCOS内分泌异常主要表现为:高雄激素血症、促性腺激素水平异常、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、糖代谢异常等，其中最重要的内分泌特征是高雄激素血症，约65％-85％的PCOS患者存在高雄激素血症。雄激素合成增多或代谢障碍均可导致雄激素升高。雄激素的合成和代谢在细胞、分子水平上受到了多种因子的调节，如胰岛素生长因子、肾素、瘦素等，目前已知的因子主要是通过对下丘脑-垂体-卵巢轴、肾上腺等的作用，来影响雄激素的生成及转化过程。
　　 近年来研究发现，在雄激素向雌激素转化过程中存在一种重要的酶，可以限制其生物反应速率，被认为是该反应的限速酶，这种酶被称为细胞色素P450芳香化酶(aromatase cytochrome P450，P450arom)。P450arom在多种组织中均有表达，如卵巢、肝脏、肌肉、脂肪组织、乳腺组织等，根据各组织中雄激素底物的不同生成不同活性的雌激素。在卵巢中，颗粒细胞和膜细胞中均可见P450arom的表达，同时，雄激素向雌激素的转化主要在颗粒细胞中进行，主要以睾酮(testosterone，T)为底物，转化生成雌二醇(estradiol，E2)，少部分则以雄烯二酮为底物转化生成雌酮。由于P450arom是睾酮向雌二醇转化过程中的限速酶，减少的其生成或抑制其活性都将直接影响该转化去路的进行，睾酮堆积造成卵巢局部的雄激素水平升高、出现高雄激素血症，高雄激素血症又可以进一步加剧排卵障碍。因此，有学者认为PCOS患者可能存在P450arom活性的不足。研究表明，P450arom的表达受多种调节因子影响和调控，如促性腺激素、类固醇激素受体、细胞因子、CYP19基因的单核苷酸多态性、CYP19基因突变或功能缺失等均可导致P450arom的表达改变。目前，P450arom的具体影响机制尚未研究透彻。
　　 过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma，PRARγ)属于核受体超家族，生物学功能多样，参与糖类代谢、脂类代谢、脂肪细胞的分化、胰岛素抵抗、炎性反应及卵巢组织的周期性调控等方面均发挥重要作用。近来有研究表明，PCOS患者卵巢颗粒细胞中PRARγmRNA与其相应卵泡液睾酮T、游离雄激素指数(FAI)水平呈正相关。PPARγ激动剂可抑制人卵巢颗粒细胞P450arom活性及其mRNA表达水平。因此我们推测PCOS患者卵巢颗粒细胞中PPARγmRNA、P450arommRNA与高雄激素血症之间可能存在内在的调节关系。相关研究国内外未见报道。本研究通过在控制性超排卵周期中的收集黄素化的颗粒细胞，检测其P450arommRNA、PPARγmRNA的表达;初步探讨PPARγ、P450arom对PCOS高雄激素血症发生的作用。
　　 材料与方法：
　　 选择2012年11月至2013年1月在郑州大学第一附属医院生殖医学中心行常规体外受精-胚胎移植助孕治疗的患者共65例，分为两组:PCOS组30例（实验组）和非PCOS组35例（对照组）。促排卵方案采用我中心常规黄体期长方案:于黄体中期应用促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone agonist,GnRH-a)进行垂体降调节，待降调达标后应用促性腺激素(gonadotropin，Gn)行超促排卵，根据卵泡生长情况及内分泌变化及时调整用药，卵泡发育至有2个或2个以上卵泡直径≥18mm时提示卵泡已进入成熟阶段，于当晚注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)针，卵泡于HCG注射后36-37小时可达成熟状态，此时在阴道B超引导下行静脉全麻下穿刺取卵术。采用短时受精法，收集的卵母细胞在体外培养约4小时后，与优化的男方精子受精。根据胚胎形成情况，于2-3天后胚胎移植术，术后给予黄体支持治疗。对血清及卵泡液以酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定T、E2水平。所需血液标本分别为月经第2-3天及注射HCG日晨起空腹抽取的肘静脉血液，约4ml。卵泡液(FF)要求清亮、无血染，且要求为取卵日第一管卵泡直径＞18mm的卵泡。所收集的静脉血和卵泡液均先予低温离心机中离心10分钟，转速设定为2000rpm/min离心，所获得的上清液即为所需血清及卵泡液，轻轻吸取后装入无菌EP管中，以封口膜封口，冻存于-80℃冰箱。收集捡卵后剩余的全部卵泡液提取颗粒细胞，进一步提取总的RNA，采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)法检测两组患者卵巢颗粒细胞P450arommRNA和PPARγmRNA表达。
　　 结果：
　　 1.P450arommRNA同时表达于PCOS组及正常组的黄素化颗粒细胞中，正常组的表达量显著高于PCOS组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2.PCOS组卵巢颗粒细胞P450arom mRNA表达水平与卵泡液中E2水平呈正相关性(r=0.515，P＜0.05)，与卵泡液中T水平呈负相关性(r=-0.631，P＜0.05)，与IVF-ET结局无相关性(P＞0.05)。
　　 3.PPARγmRNA同时表达于PCOS组及正常组的黄素化颗粒细胞中，PCOS组的表达量显著高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4.PCOS组卵巢颗粒细胞PPARγmRNA表达水平与卵泡液中T水平呈正相关性(r=0.248，P＜0.05)，与卵泡液中E2水平呈负相关性(r=-0.387，P＜0.05)，与IVF-ET结局无相关性(P＞0.05)。
　　 5.PCOS组卵巢颗粒细胞PPARγmRNA表达水平与P450arommRNA表达水平呈负相关性(r=-0.569，P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1.PCOS中卵巢颗粒细胞P450arom呈低表达，PPARγ呈高表达，两者均与卵泡液中T、E2有相关性，可能共同通过促进雄激素的生成参与PCOS的发病。
　　 2.PCOS卵巢颗粒细胞PPARγmRNA表达水平与P450arom mRNA表达水平有相关性，两者可能共同参与了高雄激素的生成通路。
　　 3.PCOS卵巢颗粒细胞PPARγ及P450arom的表达与IVF-ET结局可能无关。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

2．3 统计学分析

结果

3．1 两组患者一般资料的比较

3．2 两组患者体外受精-胚胎移植结局的比较

3．3 两组患者血清和卵泡液中甾体激素水平的比较

3．4 相关分析

3．5 两组颗粒细胞上P450芳香化酶mRNA的表达

3．6 颗粒细胞P450arom mRNA与IVF-ET结局的相关性分析

3．7 颗粒细胞P450arom mRNA与卵泡液甾体激素的相关性分析

3．8 两组颗粒细胞上PPARγ mRNA的表达

3．9 颗粒细胞PPARγ mRNA与IVF-ET结局的相关性分析

3．10 卵巢颗粒细胞PPARγ mRNA与卵泡液甾体激素的相关性分析

3．11 卵巢颗粒细胞P450arom mRNA与PPARγ mRNA的相关性分析

讨论

4．1 PCOS的卵泡发育情况

4．2 颗粒细胞P450芳香化酶与PCOS

4．3 PPARγ、P450arom与高雄激素血症

4．4 PPARγ、P450arom与IVF-ET结局

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历

攻读硕士期间发表论文