靶向TLR2联合促渗剂增加基因透皮效率的作用及机制研究

摘要

第一章:促渗剂二甲基亚砜在小鼠透皮实验中的最适浓度研究 研究目的：检测二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)的不同浓度是否影响报告基因pORF-LacZ透过小鼠皮肤的转染效率以及探讨DMSO在促进报告基因pORF-LacZ经皮渗透效率过程中的最适浓度，为二期实验中应用最适浓度的DMSO制剂促进pORF-LacZ基因透过皮肤（皮瓣）作进一步研究奠定理论基础。研究方法:选取8周龄清洁级健康雄性Balb/c小鼠（购买于南方医科大学动物实验中心）20只，体重20-22g，实验室环境:环境温度为22.0±2.0℃，相对湿度55.6％±4％。按浓度不同随机分为0％DMSO组，5％DMSO组，10％DMSO组，30％DMSO组4组，每组5只小鼠。DMSO配方的浓度主要以在总体积150ul中DMSO所占百分比为基础，各配方中DMSO的浓度分别为30％(formula1)，10％(formula2)，5％(formula3)，0％(formula4)，每个配方中均含有150ug的报告基因pORF-LacZ质粒。按如下步骤操作:每只小鼠以1％戊巴比妥钠溶液进行腹腔注射麻醉后固定，于小鼠背部中央设计一个蒂在头侧的模拟随意型皮瓣(蒂宽1cm、长3cm)，在转染皮肤之前，脱毛膏背部脱毛，3-5 min后，用0.9％氯化钠溶液（生理盐水）处理15 min，随后于小鼠背部皮瓣相应区域涂抹20ul含0.05％维甲酸(retinoic acid，RA)（维甲酸溶于0.9％氯化钠溶液中）、20ul的浓度为1％ Toll样受体2(Toll like receptor2，TLR2)抑制剂——脂质羊毛硫氨酸肽(lipolanthionine peptides，LP)及DMSO混合制剂，这个过程每隔一天进行一次，连续1周。到第7天，当涂抹最后一次DMSO、LP和RA混合制剂4小时后，用移液器吸取10ul的混合物（150ug的pORF-LacZ和15ul的不同浓度DMSO溶于水中，总体积为150ul）均匀地涂抹于小鼠背部皮瓣上，这个过程进行3天，每天1次。第4天于皮瓣下部收集透过的质粒，样本分成两份，实时荧光定量PCR检测pORF-lacz基因透过量。用水合氯醛麻醉实验小鼠，然后进行处死，并收集它们的背部皮肤样本。样本先用PBS溶液处理，而后被固定在带有一定扩散面积的扩散池中，此处包括有测定位点隔间和受体隔间，且两种隔间分别被安装在扩散池的两侧。皮肤表面朝向测定位点隔间的一侧，受体隔间中充满RPMI1640培养基，此实验过程中，pEGFP-N1质粒(5ug)被加入到培养基中作为内参。已经准备好的基于不同浓度的DMSO等混合制剂被加到测定位点隔间。受体隔间中的培养基在整个实验当中以45转/min的转速进行搅拌。整个装置被置于37.0±0.5℃的环境条件下。 取样后，背部皮肤在2％的甲醛和0.2％的戊二醛的混合液当中浸泡2-4小时，溶液的温度保持在4℃的环境下，然后在室温下先后用三种不同浓度的PBS(PH7.4)洗涤60 min，接着所有的样本在37.0℃的环境下被置于1 mg/mlⅩ-gal当中浸泡过夜。第2天，所有的样本在室温条件下先后用三种不同浓度的PBS(PH7.4)洗涤60 min，接着在室温条件下被放置于10％福尔马林溶液当中浸泡24小时，然后用水冲洗过夜。 研究结果：在不同浓度DMSO混合制剂的作用下，报告基因pORF-lacz透皮表达量分别为(F=337.718): a.当DMSO浓度为10％时，pORF-lacz基因透皮表达量最高(5.378±0.346μg/cm2)，显著性高于另外三组，P=0.000，差异具有统计学意义; b.DMSO浓度为0时，pORF-lacz基因透皮表达量最低(0.940±0.095μg/cm2)，显著性低于另外三组，P=0.000，差异具有统计学意义; c.而DMSO浓度为5％和30％时，pORF-lacz基因透皮表达量居中(分别为2.376±0.190μg/cm2和2.516±0.199μg/cm2)，两者之间差异并无统计学意义。 结论:当DMSO浓度为10％时，报告基因pORF-lacz透皮表达量最高，可确定此为促进报告基因透过小鼠皮肤的最适使用浓度，因此在本课题进一步研究中，将选用浓度为10％的DMSO作为关键促渗剂。 第二章:RA和LP对小鼠皮肤claudin-4和ZO-1影响的实验研究 研究目的：探讨经10％DMSO作为促渗剂，维甲酸(retinoic acid，RA)和Toll样受体2(Toll like receptor2，TLR2)抑制剂——脂质羊毛硫氨酸肽(lipolanthioninepeptides，LP)按照分组施加干预后，小鼠皮肤连接蛋白claudin-4和ZO蛋白-1(ZO-1)表达的改变情况和皮肤相应透过功能的变化规律。 研究方法：选取8周龄清洁级健康雄性Balb/c小鼠（购买于南方医科大学动物实验中心）30只，体重20-22g。实验室环境:环境温度为22.0±2.0℃，相对湿度55.6％±4％。将小鼠随机分为5组:RA+LP+DMSO+pORF-LacZ;DMSO+pORF-LacZ; LP+DMSO+pORF-LacZ; RA+DMSO+pORF-LacZ;生理盐水对照组，每组6只。 按如下步骤操作:选取8周龄小鼠背部一定面积(1cm×1cm)的皮肤，用脱毛膏脱出此选定皮肤区域的毛发，3-5min后，用0.9％氯化钠溶液处理，15min后，按照分组，小鼠背部皮肤分别被涂抹20ul含0.05％维甲酸（RA）（维甲酸溶于0.9％氯化钠溶液中）+10％DMSO制剂和20ul的浓度为1％TLR2抑制剂LP+10％DMSO制剂，或者涂抹两者的联合制剂+10％DMSO制剂，或者10％DMSO制剂，这个过程每隔一天进行一次，连续1周，对照组作同样处理。第7天，最后用上述相应制剂处理后，施用最适浓度10％DMSO配置的pORF-LacZ质粒，处理过程进行3天，每天1次，第4天处死小鼠，收集皮肤标本，然后运用皮肤免疫组化和western blot检测紧密连接蛋白claudin-4和ZO蛋白-1(ZO-1)的表达情况。 背部皮肤在2％的甲醛和0.2％的戊二醛的混合液当中浸泡2-4小时，溶液的温度保持在4℃的环境下，然后在室温下先后用三种不同浓度的PBS(PH7.4)洗涤60min，接着所有的样本在37.0℃的环境下被置于1 mg/mlⅩ-gal当中浸泡过夜。第2天，所有的样本在室温条件下先后用三种不同浓度的PBS(PH7.4)洗涤60min，接着在室温条件下被放置于10％福尔马林溶液当中浸泡24小时，然后用水冲洗过夜。 研究结果： 1.根据HE染色图片所示:DMSO、RA和LP干预后的实验组小鼠皮肤角质层细胞连接间隙增大，细胞连接疏松，生理盐水对照组小鼠的皮肤并未出现上述现象;所有的实验组小鼠皮肤并未出现病理性的破坏。在各实验组中，DMSO组和RA+DMSO组小鼠皮肤略微出现了皮肤乳头状突起、皮肤水肿、中性粒细胞聚集和毛细管扩张等现象，与之相比，LP+DMSO组和RA+LP+DMSO组的小鼠皮肤水肿现象减少，毛细血管扩张现象有所缓解。 2.免疫组化实验结果: (1)claudin-4的表达情况(F=16.174，P=0.000): a.与盐水对照组相比，RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ两组目的蛋白—claudin-4的表达量（分别为29.827±2.849、32.932±4.890）显著低于前者的蛋白表达（42.830±3.865）(p＜0.01)，差异具有显著统计学意义; b.与RA+DMSO+pORF-LacZ相比，RA+LP+DMSO+pORF-LacZ目的蛋白—claudin-4的表达量(29.827±2.849)显著低于前者的蛋白表达（39.388±2.053）(p＜0.01)，差异具有显著统计学意义; c.LP+DMSO+pORF-LacZ目的蛋白—claudin-4的表达量(32.932±4.890)低于RA+DMSO+pORF-LacZ组的蛋白表达（39.388±2.053）(p＜0.05)，差异具有统计学意义; d.与 DMSO+pORF-LacZ组相比，RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ两组目的蛋白—claudin-4的表达量（分别为分别为29.827±2.849、32.932±4.890）显著低于前者的蛋白表达（40.202±1.872）(p＜0.01)，差异具有统计学意义。 (2)zo-1蛋白表达情况(F=97.827，P=0.000): a.与盐水对照组相比，RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ、RA+DMSO+pORF-LacZ、DMSO+pORF-LacZ四组目的蛋白—zo-1的表达量（分别为21.367±1.892、31.613±0.911、32.047±1.976、34.697±1.748）显著低于盐水对照组的蛋白表达量（41.473±2.174）(p＜0.01)，差异具有显著统计学意义; b.RA+LP+DMSO+pORF-LacZ目的蛋白—zo-1的表达量（21.367±1.892）显著低于RA+DMSO+pORF-LacZ组的蛋白表达量（32.047±1.976）(p＜0.01)，盐水对照组目的蛋白表达量（41.473±2.174）显著高于RA+DMSO+pORF-LacZ组的蛋白表达量（32.047±1.976）(p＜0.01)，差异具有显著统计学意义; c.DMSO+pORF-LacZ目的蛋白—zo-1的表达量（34.697±1.748）高于RA+DMSO+pORF-LacZ组的蛋白表达（32.047±1.976）(p＜0.05)，差异具有统计学意义; d.与 DMSO+pORF-LacZ组相比，RA+LP+DMS O+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ组目的蛋白—zo-1的表达量（分别为21.367±1.892、31.613±0.911）显著低于前者（34.697±1.748）(p＜0.01)，差异具有显著统计学意义。 e.RA+LP+DMSO+pORF-Lac组目的蛋白—zo-1的表达量显著低于LP+DMSO+pORF-LacZ组表达量(分别为21.367±1.892、31.613±0.911)(p＜0.01)，差异具有显著统计学意义。 3.Western blot实验结果: (1)claudin-4的表达情况(F=124.557，P=0.000): a.与盐水对照组相比，RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ、RA+DMSO+pORF-LacZ三组目的蛋白—claudin-4的表达量(分别为0.208±0.018、0.241±0.020、0.285±0.017)显著低于前者的蛋白表达（0.458±0.031）(p＜0.01)，差异具有统计学意义; b.与DMSO+pORF-LacZ组相比，RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ、RA+DMSO+pORF-LacZ三组目的蛋白—claudin-4的表达量（分别为0.208±0.018、0.241±0.020、0.285±0.017）显著低于前者的蛋白表达（0.410±0.030）(p＜0.01)，差异具有统计学意义。 c.与RA+DMSO+pORF-LacZ组相比，RA+LP+DMSO+pORF-LacZ、LP+DMSO+pORF-LacZ组目的蛋白—clau

目录

摘要

第一章 促渗剂二甲基亚砜在小鼠透皮实验中的最适浓度研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二章 RA和LP对小鼠皮肤claudin-4和ZO-1影响的实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三章 RA和LP对pORF-lacz透皮效率影响的实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述1 TLRs信号通路及在皮肤创伤修复中的研究进展

综述2 Toll样受体与皮瓣缺血再灌注损伤的相关问题研究

附录 英语缩略词列表

攻读博士学位期间成果

声明

统计学审稿证明