促性腺激素释放激素激动剂治疗子宫内异位症患者在位内膜的蛋白质组学研究

摘要

子宫内膜异位症(简称内异症，Endomctriosis，EMS)是指具有生物学活性的子宫内膜种植在子宫腔以外的组织中，主要临床症状表现为痛经、不孕、慢性盆腔痛及性交痛等，是育龄期妇女常见病、多发病之一。据报道其发病率高达3％～10％，且近年来有明显增高的趋势，其中30％-50％的内异症患者伴发不孕，30％～58％的不孕症患者合并内异症，因而内异症对患者的身心健康及生活质量有很大影响。此疾病虽是一种良性疾病，但却具有转移、种植等恶性行为。内异症的发病机理尚未研究清楚，但多项研究表明与正常妇女相比内异症患者血清、腹腔液中多种生化分子的表达均增高，如癌抗原CA-125、CA19-9、抗子宫内膜抗体以及某些细胞因子等，同时内异症患者的在位子宫内膜生化特性也发生了改变。目前子宫内膜异位症诊断的金标准是腹腔镜检查结合病理学诊断，但可以代替腹腔镜作为内异症诊断的简单、无创的金标准仍缺乏，临床有将上述表达变化的生物学分子用作辅助诊断手段，但它们的敏感性和特异性不高，而且诊断界值尚未确定，故仅具有临床参考价值。 目前，治疗方法有药物治疗、手术治疗以及辅助生育等，其中药物治疗分为:性激素治疗、中药治疗及其他治疗;手术治疗分为腹腔镜下手术和开腹手术。手术方式包括:保守性手术即保留生育功能手术，半根治性手术即保留卵巢功能手术，根治性手术即全子宫切除与双侧附件切除术及病灶切除。尽管目前有各种治疗方法与措施，但均未真正起到根治的作用，也未取得长久消除症状的效果。子宫内膜异位症经典的治疗模式为腹腔镜手术+药物治疗。经典的药物主要是GnRHa、口服避孕药、丹那唑、孕三烯酮等。它们疗效确切，但是停止治疗后数月往往复发。其中应用较广的是GnRHa，在疾病治疗方面，缩小病灶、延缓复发、减轻盆腔疼痛等疗效明显，但药理作用机制仍然不明确。 近年来，虽然有较多的研究对子宫内膜异位症的发病机制进行了报道，但是确切的机制我们仍不清楚。子宫内膜异位症的发病机制，目前尚未完全明确。其可能的发病机制是子宫内膜随经血逆流进入盆腔，在某些因素的作用下，机体不能清除逆流进入盆腔的子宫内膜，异位内膜则在其种植、生长和转移，其中必须通过粘附、侵袭、血管形成三个步骤来完成。目前发现如下几种重要分子可能与发病有关:包括基质金属蛋白酶MMP、调亡抑制蛋白IAP家族成员的Survivin、血管内皮生长因子VEGF等。它们的相互作用引起子宫内膜在盆腹腔内生长、发展，但具体的机制并不清楚。这也阻碍了我们制定更具针对性的治疗子宫内膜异位症的有效方案。因此，继续深入研究GnRHa对治疗子宫内膜异位症有效的机制具有重要意义，不仅可从侧面了解内异症的致病机理，而且可以帮助我们探索寻找更有效的靶向治疗药物。目前，国内外有GnRHa与蛋白质组学方面的研究，但是尚无GnRHa治疗前后在位内膜在差异蛋白质研究。 随着人类基因组学研究的逐渐完成，生命科学的探索已经进入了后基因组时代，即蛋白质组时代。蛋白质组学研究方法有很多种，与传统的研究手段相对，这些方法具有高通量、高效率、高准确性等特点，目前已经被广泛应用于多方面的研究。应用蛋白质组学的研究方法对内异症患者的血清以及在位子宫内膜组织的蛋白质表达变化进行研究，以寻找与内异症发生、发展相关的蛋白质，这将有助于内异症的诊断以及复发的预测。 双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)于1975年首先由O' Farrell等创立，其原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)把复杂的蛋白质成分分离。该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质抽提物，构建特定组织或细胞蛋白质的“二维电泳图谱”，分析特定条件下蛋白质的表达状况，进行蛋白质组差异比较。由于2-DE利用了蛋白质两个彼此不相关的重要性质对其进行分离，因此分辨率非常高，一般能分辨到1000-3000个蛋白质样点。最好的胶可分离得到11000个左右的蛋白质样点。但这与庞大的蛋白质组组分相比远远不能满足需要，因此，样品的制备和发展预分离方法是很有用的。然而，目前该技术仍是蛋白质组研究的核心技术。 二维电泳分离后的蛋白质经染色后显示进行鉴定，二维电泳中的显色是一个重要步骤，常用的显色方法有考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色或同位素标记等。传统的染色方法银染和考马斯亮蓝法染色，二者均有一定的弊端。银染的线性范围较窄，重复性差，考马斯亮蓝法染色灵敏度较低。最近研究发现荧光染色法，其灵敏度与银染相似，但速度更快，线性范围更宽，同时减少了对质谱鉴定的影响。四种常用方法比较，银染法是非放射性染色方法中最灵敏的，其灵敏度可达到1ng甚至更低。但是灵敏的还是利用同位素标记，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。图像分析也是二维电泳研究的重要方面。染色后可用图像扫描仪、激光光密度仪、磷光或荧光测定仪等建立双向凝胶电泳图谱。此外，还要对不同组织、不同细胞表达的蛋白质图谱进行比较，除掉凝胶图谱的纹理和背景，找到表达上差异的蛋白质点，确定有生物意义的蛋白质。 差异凝胶电泳(differential in-gel electrophoresis，DIGE)用来检测蛋白质在两种样品中表达情况。对两种样品中的蛋白质采用不同荧光标记后混合，进行双向凝胶电泳，用荧光显微镜观察，如果同一斑点显示两种荧光，说明一种蛋白质同时在两个样品中表达;如果一个斑点只显示一种荧光，该蛋白质只在相应的样品中表达。差异凝胶电泳技术是双向电泳技术的新发展，它最大的优点是通过在同一块凝胶上电泳，完全排除了由于电泳的重复性问题可能导致的误差，大大提高了结果的可信度。可以用此种技术对不同样品蛋白质表达差异进行分析，如对来自正常组织和癌变组织的样品蛋白质表达差异进行分析。但是该项技术还是有一定弊端的，如该方法是将荧光染料标记在赖氨酸残基上的，对于不含赖氨酸的蛋白质则难以使用，同时该方法所用的仪器及试剂较昂贵，较难以普遍使用。 2-D DIGE是在双向电泳技术的基础上引入了荧光标记和内标，通过与荧光染料高度匹配的荧光成像仪获取三通道信号，以消除凝胶之间差异，从而检测样品间的蛋白质组表达差异。2-DDIGE是一种高通量的蛋白质组学研究技术，因此我们课题采用2-D DIGE对子宫内膜异位症患者在GnRHa治疗前后在位内膜细胞进行蛋白质差异研究。以期从中筛选到与子宫内膜异位症发生密切相关的蛋白并明确其作用机制，为阐明子宫内膜异位症的发病机制提供实验依据。 目的:分析GnRHa治疗前后子宫内膜异位症患者在位内膜蛋白表达的差异，分析其发生的原因并揭示相关发生机制，为阐明子宫内膜异位症的发病机制提供实验依据。 方法:本研究采集了GnRHa治疗前后子宫内膜异位症患者的在位内膜组织，采用了TUNEL染色法和Western blot检测组织内细胞凋亡情况;用2-DDIGE检测GnRHa治疗前后子宫内膜异位症患者的在位内膜组织内差异蛋白的表达情况，筛选有意义的蛋白，并应用Western blot和免疫组织化学技术对他们的表达水平进行验证;从子宫内膜异位症患者在位内膜活检组织中原代分离培养子宫内膜上皮细胞，TUNEL染色法和Westernblot检测GnRHa对培养细胞凋亡的诱导作用，并检测GRP78的表达量;干扰和过表达GRP78的表达量检测在位内膜上皮细胞的凋亡率。 结果: 1.GnRHa治疗诱导在位内膜上皮细胞凋亡取GnRHa治疗前后病人在位内膜组织样本，提取总蛋白后，用Western blot检测caspase3的蛋白表达量。结果显示，使用GnRHa后，caspase3表达量升高。相同组织标本进行石蜡切片后，TUNEL和Hoechst共标记检测组织原位凋亡情况。结果显示，使用GnRHa后，子宫内膜异位症病人在位内膜组织凋亡细胞增加。以上结果说明，使用GnRHa可诱导子宫内膜异位症患者在位内膜上皮细胞的凋亡。 2.子宫内膜异位症病人GnRHa治疗前后在位内膜蛋白差异表达的研究取GnRHa治疗前后病人的在位内膜组织样本，应用2-D DIGE对组织蛋白的差异表达情况进行研究。结果发现55个差异表达的蛋白，其中26个蛋白经过MALDI-TOF/TOF MS鉴定，包括12个上调蛋白和14个下调蛋白。按功能可分为，6个分泌蛋白、4个细胞骨架蛋白、4个分子伴侣、4个蛋白具有催化活性、2个蛋白参与氧化还原反应、2个是细胞膜蛋白和其他蛋白。 应用Western blot和免疫组化验证由2-D DIGE筛选出的四个GnRHa治疗前后子宫内膜异位症病人在位内膜组织中差异蛋白的表达。这四个蛋白是:GRP78、PPA1、EFHA2和TGM2。GAPDH作为内参，Western blot检测子宫内膜异位症病人在位内膜组织中GRP78、PPA1、 EFHA2和TGM2的蛋白水平。结果显示GRP78和PPA1在子宫内膜异位症患者治疗后下调，而EFHA2和TGM2则上调。用免疫组织化学法检测子宫内膜异位症病人在位内膜组织切片中GRP78、PPA1、EFHA2和TGM2的表达，结果与Western blot检测结果相同。GRP78和PPA1在子宫内膜异位症患者治疗后下调，而EFHA2和TGM2则上调。 3.GnRHa诱导体外分离的子宫内膜上皮细胞凋亡检测原代分离培养来自子宫内膜异位症病人的在位内膜上皮细胞，TUNEL和Western blot检测caspase3在醋酸亮丙瑞林处理后细胞凋亡检测。结果显示，原代分离培养来自子宫内膜异位症病人的在位内膜上皮细胞经醋酸亮丙瑞林处理后，TUNEL染色阳性细胞增加。Western blot检测醋酸亮丙瑞林处理的原代分离培养来自子宫内膜异位症病人的在位内膜上皮细胞caspase3表达量，显示处理后caspase升高。提示，GnRHa可以诱导原代分离培养来自子宫内膜异位症病人的在位内膜上皮细胞发生凋亡。 4.GRP78对GnRHa处理后在位内膜上皮细胞凋亡的影响Western blot检测GnRHa对原代分离培养来自子宫内膜异位症病人在位内膜上皮细胞的GRP78表达情况。结果显示，GnRHa对子宫内膜上皮细胞的GRP78有下调作用，说明GRP78参与GnRHa诱导在位内膜上皮细胞凋亡的负调控。应用siRNA干扰原代培养的在位内膜上皮细胞表达GRP78，再用醋酸亮丙瑞林处理后，细胞凋亡率增加;构建GRP78过表达载体，再用醋酸亮丙瑞林处理后细胞凋亡率减低。从正反面进一步验证了GRP78参与GnRHa对子宫内膜异位症病人在位内膜上皮细胞凋亡的负调节反应。 结论: 1.子宫内膜异位症患者GnRHa治疗后可诱导在位内膜上皮细胞的凋亡; 2.2-D DIGE检测子宫内膜异位症病人GnRHa治疗前后在位内膜的差异蛋白表达并进行验证，结果有55个差异表达的蛋白，其中GRP78和PPA1在子宫内膜异位症患者治疗后下调，而EFHA2和TGM2则上调; 3.GnRHa可以诱导原代分离培养的来自子宫内膜异位症病人的在位内膜上皮细胞的凋亡; 4.对GRP78调节患者GnRHa治疗后诱导在位内膜上皮细胞凋亡的作用进行研究，发现GRP78可以负向调控GnRHa诱导的在位内膜上皮细胞的凋亡。

目录

摘要

前言

材料方法

一．实验材料

二．实验方法

三．统计学分析

实验结果

1．GnRHa诱导子宫内膜上皮细胞凋亡

2．差异蛋白质学研究

3．GnRHa诱导体外分离的在位内膜上皮细胞凋亡检测

4．GRP78对GnRHa处理后在位内膜上皮细胞凋亡的影响

讨论

结论

参考文献

综述 药物治疗在子宫内膜异位症的研究进展

博士研究生期间发表论文情况

致谢

声明

统计学审稿证明