LuxS/AI-2密度感应信号影响草绿色链球菌生物膜致病力的研究

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述：
　　第1章 VS多药耐药野生株的分离与鉴定
　　目的：获得研究所需目标菌株——草绿色链球菌多药耐药临床分离野生株。
　　方法：临床标本通过血平板培养、革兰染色、药敏试验筛选出疑似目标菌株;纯培养后行生理、生化试验，提取细菌基因DNA，多聚酶链式反应(PCR)扩增16SrDNA，测序后上传至NCBI数据库与已知序列比较，行16S rDNA序列同源性分析。
　　结果：临床分离多药耐药野生株(327045号)，革兰染色阳性链球菌;α溶血;生化实验提示D群链球菌，缓症链球菌可能性大;16S rDNA序列同源性分析显示与缓症链球菌(S.mitis)同源性最高，99.58％。
　　结论:临床分离野生株(327045号)属于草绿色链球菌多药耐药野生株。成功获得本研究所需目标菌株。
　　第2章 VS多药耐药野生株的致病力检测
　　目的:了解目标菌株——草绿色链球菌多药耐药临床分离野生株的致病力，为下一步比较实验获取基线数据。
　　方法:通过野生株上清液诱导V.harveyiBB170报告菌株生物发光实验检测VS多药耐药野生株AI-2信号分子的存在与活性;酶标仪测量VS多药耐药野生株形成生物膜的吸光光度值，了解其生物膜形成能力;定量分析不同时间、不同类型、不同浓度抗生素对VS野生株生物膜形成量的影响，了解其耐药性，数据输入SPSS17.0统计学软件，进行析因资料方差分析和单因素方差分析;Fluorecein Stain、18909 Calcofluor White Stain、DEAD/LIVE Backlight Bacteria Viability stain荧光染色后，激光共聚焦显微镜扫描观测VS多药耐药野生株生物膜结构、胞外多糖分布、死活菌分布，全面了解VS多药耐药野生株的致病力表型。
　　结果:析因资料方差分析显示抗生素种类与浓度(P=0.034)、抗生素种类与干预时间(P＜0.001)、抗生素浓度与干预时间(P=0.010)皆存在交互作用;主效应分析显示抗生素类型(P＜0.001)、抗生素浓度(P＜0.001)、干预时间(P＜0.001)均可影响VS多药耐药野生株的BF形成。经单因素方差分析Dunnett t-tests多重比较显示初始期，环丙沙星耐药浓度(P=0.001)、中敏浓度(P＜0.001)、敏感浓度(P＜0.001)，四环素耐药浓度(P=0.012)、中敏浓度(P=0.009)、敏感浓度(P=0.001)实验组中抗生素均有效减少了VS多药耐药野生株BF的形成;中间指数期，实验组BF形成量与菌液对照组均不存在显著性差异(P＞0.05)。生物膜结构复杂，且不均一;胞外多糖、死活菌分布特点多样，可受抗生素干预因素影响。
　　结论:VS多药耐药野生株具有极强的生物膜形成能力和多重耐药性，致病力高，值得临床关注;抗生素治疗应遵循实验室检查结果。
　　第3章 VS LuxS基因突变株的构建
　　目的:通过同源重组法敲除VS多药耐药野生株的LuxS基因，构建VS LuxS基因突变株，为进一步研究LuxS基因在VS生物膜形成与耐药性变化中的作用做准备。
　　方法:运用同源重组法设计合成引物，分别以质粒PMG36E、VS多药耐药野生株(327045)DNA为模板，应用聚合酶链反应(PCR)扩增得到红霉素抗性(Erm.)基因DNA片断和LuxS基因上下游序列，经双酶切反应插入pUC19质粒的多克隆酶切位点中，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉和红霉素培养基筛选，将载体质粒转化到含完整LuxS基因的VS多药耐药野生株(327045)中，利用红霉素抗性培养基筛选出LuxS基因缺陷突变株，并利用聚合酶链式反应(PCR)检测。
　　结果:PCR凝胶电泳结果显示:红霉素抗性基因和LuxS基因两侧同源序列成功连入到Puc19质粒相应酶切位点，VS LuxS基因突变株LuxS基因完全被红霉素抗性(Erm.)基因所取代。
　　结论:成功构建VS LuxS突变株。
　　第4章 LuxS基因缺失对VS野生株致病力的影响
　　目的:了解LuxS/AI-2密度感应信号缺失对VS多药耐药野生株生物膜致病力的影响，尝试探讨可能存在的机制。
　　方法:V.harveyi BB170报告菌株生物发光实验检测AI-2信号分子的存在与活性;吸光光度值定量分析VS多药耐药野生株与LuxS基因突变株生物膜形成量与耐药性差异;Fluorecein Stain、18909 CalcofluorWhite Stain、DEAD/LIVE Backlight Bacteria Viability stain荧光染色后，激光共聚焦显微镜扫描VS多药耐药野生株与LuxS基因突变株BF，比较二者在生物膜结构、胞外多糖分布、死活菌分布方面的差异;通过野生株上清液、DPD补偿生长实验确认VS突变株表型发生的原因。数据输入SPSS17.0统计学软件，进行Kolmogorov-Smirno test非参数检验。
　　结果:Kolmogorov-Smirno test显示:VS LuxS基因突变株与野生株菌液BF形成量存在显著性差异(P＜0.001);同样条件下，氨苄西林(P＜0.001)、环丙沙星（P＜0.05）、四环素(P＜0.001)干预VS LuxS基因突变株与野生株BF形成量均存在显著性差异。突变株菌液BF形成量与VS野生株上清液、DPD补偿实验组BF形成量，均存在显著性差异（P＜0.001）;野生株菌液BF形成量与VS野生株上清液(P=0.320)、DPD(P=0.683)补偿生长实验组BF形成量均不存在统计学差异。VS LuxS基因突变株生物膜形成量减少，结构疏松改变，对氨苄西林、环丙沙星、四环素的耐药性下降，致病力降低。
　　结论:该表型是LuxS基因缺失，AI-2信号分子合成障碍，由LuxS/AI-2密度感应信号介导的细菌种间通信中断的结果。LuxS/AI-2密度感应信号能够影响VS多药耐药野生株生物膜致病力，可以作为抗菌治疗新的途径和靶标。

目录

摘要

前言

参考文献

第1章 VS多药耐药野生株的分离与鉴定

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

参考文献

第2章 VS多药耐药野生株的致病力检测

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

参考文献

第3章 VS LuxS基因突变株的构建

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

参考文献

第4章 LuxS基因缺失对VS野生株致病力的影响

4．1 材料和方法

4．2 结果

4．3 讨论

参考文献

第5章 总结

5．1 立论依据

5．2 实验方法

5．3 研究结论

5．4 展望

综述 AI-2介导的细菌通信

成果

致谢

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