新型阳离子聚合物聚磷酰胺的合成及作为基因/siRNA转运载体的体外实验研究

摘要

研究目的：
　　本研究的目的是人工化学合成一种低毒、高效的树枝状阳离子聚合物作为基因或siRNA的转移载体，通过体外一系列的化学和细胞学实验检测其作为基因或siRNA的转移载体的特性以及在多种细胞中对质粒及siRNA的转染效率以及在转染过程中所产生的毒性作用。上述研究将为该阳离子聚合物作为基因或siRNA的转移载体用于临床基因治疗相关疾病奠定理论基础。
　　研究方法：
　　二氯磷酸乙酯和N-（2-氨乙基）-N（1-甲基）-1，2-乙二胺在氮气保护下，聚合48h，得到阳离子聚磷酰胺(PPA)转染试剂。然后通过过表达（质粒）或干扰表达(si RNA)的策略探讨聚磷酰胺(PPA)包裹的PKD2表达质粒在A549细胞（人类肺癌细胞系）和HEK293（人类胚胎肾细胞）中的转染效率;通过CCK8检测细胞在含有这种新型转染试剂的培养基中的增殖情况，确定它的细胞增殖毒性;经免疫荧光染色、流式细胞仪检测、Western blot等方法证实聚磷酰胺(PPA)包裹的PKD2质粒和siRNA进入了细胞中，且能表达相应的靶蛋白，导入的siRNA能靶向性敲低基因的表达，从而证实该新型阳离子聚合物转染试剂有良好的转染效率。
　　研究结果：
　　1.聚磷酰胺聚合物的化学合成和核磁共振光谱测定
　　PPA是由二氯磷酸乙酯和N-（2-氨乙基）-N（1-甲基）-1，2-乙二胺在氮气保护下聚合得到。PPA的化学结构由核磁共振光谱来(NMR spectra)鉴定。在聚合物1H NMR谱图中，δ=4.512-4.72ppm和1.09-1.31ppm处为亚甲基和甲基(-POCH2CH3)的氢质子峰;δ=2.62-3.08ppm是亚甲基和甲基(-NCH2CH2)N(CH3)CH2CH2N-)的氢质子峰。我们进一步测定了聚合物的31p核磁共振光谱(31p NMR)。PPA的共振最高为δ=10.02 ppm，说明二氯磷酸乙酯和N-（2-氨乙基）-N（1-甲基）-1，2-乙二胺进行缩聚得到聚磷酰胺。
　　2.聚磷酰胺结合DNA能力检测
　　为了证明PPA对DNA的结合能力，即证明PPA和pDNA复合物的形成。用含EB(溴化乙锭)的1.0％的凝胶来进行凝胶阻滞电泳，发现低浓度的PPA(0.5μg/μL)和高浓度的PPA（1μg/μL）分别与0.5μg的pDNA形成的聚合物显示，在特定的N/P比率下PPA能够有效的包裹pDNA，在N/P比率为8和更高的比率下PPA/pDNA会完全的滞留在上样孔上。当pDNA的浓度为1.0μg情况下，在比N/P为4或者更高的N/P比率时复合物完全失去了移动的能力，表明合成的聚磷酰胺能有效包裹DNA分子。
　　3.PPA/pDNA复合物颗粒大小和电极电位测定
　　PPA/pDNA多聚体混合物的粒子大小和电极电位已被证明影响细胞吸收，内吞作用通路，入核作用和转染效率[24，25]。多种不同重量比(N/P比率)的PPA/pDNA多聚体复合物的合成是通过将pDNA和PPA溶液在pH7.4的10 mMTris-HC1缓冲液中配成的。该PPA/pDNA多聚体混合物不同重量比(N/P比率)的颗粒大小和多聚复合物的电极电位测量是通过Nano-ZS ZEN3600检测的。所有的PPA/pDNA多聚体混合物的大小测量范围都是在1∶1至16∶1的重量比范围，所有的PPA/pDNA多聚体混合物的直径范围大小在100到166nm之间。我们同时发现随着N/P比率增加，PPA/pDNA多聚体混合物的直径会出现轻微的下降。
　　进一步我们通过Nano-ZS ZEN3600的电极电位分析能力与动态光散射能力来测定PPA结合的质粒DNA的电极电位，随着PPA/pDNA多聚体混合物的N/P比率的增加，混合物的电压也从26.6mv上升到38.4mv。由于核酸都是带有负电荷的，通过静电作用，因此带有正电荷的PPA/pDNA多聚体混合物更加容易用于细胞实验。
　　4.聚磷酰胺(PPA)的细胞毒性检测
　　为了探讨PPA的毒性作用，我们进行CCK-8毒性测试以期了解不同浓度的PPA对人类肺癌细胞A549和人类肾胚胎细胞HEK293的毒性作用。PPA的测试浓度范围是在15-30μg/mL。在PPA浓度为15μg/mL情况下，与DMSO对照组相比较，经PPA处理的A549细胞和HEK293细胞在数量、形态等方面并未有明显的不同。并且在PPA浓度为30μg/mL情况下，与DMSO对照组相比，A549细胞和HEK293细胞仍然具有相对较低的毒性，并且我们发现PPA在HEK293细胞中比在A549细胞中具有较低的毒性。
　　为了进一步明确PPA的毒性与孵育时间的相关性，HEK293细胞在PPA浓度为15μg/mL时，分别孵育12h，24h，36h。在不同的时间段，我们发现在15μg/mLPPA浓度下，HEK293细胞和DMSO对照组相比并没有明显的细胞毒性。综上所述，PPA体外测试表明PPA细胞毒性作用低从而有望成为理想的体内或者是体外基因转移载体。
　　5.聚磷酰胺(PPA)介导的质粒转染效率和生物功能活性检测
　　我们利用PPA包裹带有GFP标签的pEGFP质粒，并转染HEK293细胞。荧光显微镜显示在N/P比率为3∶1时，PPA显示出与商用化的转染试剂Lipofectamine2000和Hilymax相比较的转染效率和相似的GFP荧光强度。流式细胞仪进一步定量显示PPA转染的细胞中GFP的荧光量达64％，与Lipofectamine2000(62％)相当，而高于Hilymax(48％)。
　　PKD的磷酸化可特异性激活NF-κB信号通路，其中IκB的降解是NF-κB信号通路激活的关键[26-28]。为此，我们使用PKD的特异性激动剂PMA作刺激因子，探讨PPA包裹的外源性质粒PKD2的转染，是否能有效表达PKD2蛋白，该蛋白是否受PMA的激活，继而激活下游NF-KB信号通路。Western blot检测表明，PPA能有效将外源性的GFP-PKD2质粒高效的转染进入A549细胞中，并且过表达PKD2。同时，PMA处理细胞30min后，能明显提高内源性和外源性PKD在 S744/748磷酸化位点的磷酸化水平，而且，在PMA的刺激下，外源性GFP-PKD2的过表达明显降低IκB的表达水平，表明PKD的表达和激活促进IκB的降解。上述研究提示PPA能够有效的转移外源基因到靶细胞内，并有效地表达和激活下游信号通路，从而在细胞中执行特定的功能。
　　为了进一步证实PPA是否可以同时包裹多个外源基因，且高效地转染进靶细胞中，并在细胞中仍具有生物功能活性。我们利用PPA包裹，然后将NF-KB荧光酶素报告基因（NF-κB-luc）及内参照报告基因海肾荧光素酶[pGL4.74(hRluc/TK)]分别与pEGFP、GFP-PKD2共转染HEK293细胞。血清饥饿16小时后，两组细胞在有无PMA的刺激作用下处理12小时，收集细胞裂解液，进行双色荧光素酶活性检测。各组细胞的萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值用相对荧光素酶活性(RLU)表示。结果表明，与pEGFP转染的对照组相比，GFP-PKD2的表达明显增加PMA刺激的NF-κB的转录激活活性。上述结果提示PPA能有效地包裹和转染多个外源基因进入靶细胞，外源基因的表达和激活能有效地促进下游信号通路的激活，进而最终促进与之相关的靶基因的转录激活活性。
　　6.PPA介导的siRNA的转染及蛋白核转位检测
　　为了进一步证实PPA是否同样具有包裹并有效转染siRNA，我们同样将PPA和siRNA以一定的比率(N/siRNA)混合，然后将其转染人肺癌A549细胞和HeLa细胞，孵育2天。Western blotting检测显示:在A549和HeLa细胞中，经PPA导入的siRNA-PKD2均能明显地敲低内源性PKD2的表达。为了进一步明确敲低内源性PKD2的表达是否影响TNF-α生理刺激作用对NF-κB的核转位，我们用PPA分别包裹siCTL（对照siRNA）和siPKD2并转染A549细胞和HeLa细胞，48小时后，分别在有无TNF-α作用下处理细胞12h，免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察表明，与对照组相比，经PPA转染的siPKD2能够明显降低TNF-α介导的NF-κB p65核转位。这些结果表明新合成的PPA不仅能够有效地转染质粒到靶细胞中，而且也能够与siRNA形成复合物，将siRNA有效导入靶细胞，并靶向敲低内源性靶基因的表达，从而有效降低下游信号分子的功能作用（入核）。
　　结论:
　　本研究中，我们研制开发出一种新型的阳离子聚合物-聚磷酰胺(PPA)。该阳离子聚合物在相对低的重量比的情况下可以有效地包裹DNA和siRNA。而且其具有较小尺寸的体积和较大的电动势能。在不同的细胞中进行的细胞毒性测试和体外细胞转染实验表明，PPA不仅细胞毒性低而且具有较高的体外转染效率。而且，这种合成的PPA还可以有效地转染多个外源基因进入靶细胞从而使这些外源基因得以在靶细胞中充分表达。更加重要的是，这种新合成的PPA也可以携带siRNA进入不同的靶细胞中（如肿瘤细胞A549和HEK293细胞等），使目的基因表达降低和信号通路传导减弱。这项研究为设计和合成一种高效低毒的新型阳离子聚合物聚磷酰胺作为基因和siRNA的转移载体提供了新的思路。

目录

摘要

前言

材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

实验结果

1．聚磷酰胺聚合物(PPA)的化学合成

2．聚磷酰胺的核磁共振光谱测定

3．聚磷酰胺结合DNA能力的检测

4．PPA／pDNA复合物颗粒大小和电极电位测定

5．聚磷酰胺(PPA)的细胞毒性检测

6．聚磷酰胺(PPA)介导的质粒转染效率

7．聚磷酰胺(PPA)与其他转染试剂转染效率的比较

8．聚磷酰胺(PPA)转染的GFP-PKD2在细胞内过量表达且在特定刺激下表现出磷酸化激活活性

9．荧光素酶报告基因检测表明PPA能介导多个基因进入靶细胞并表现其功能活性

10．PPA介导的siRNA的转染效率

11．聚磷酰胺(PPA)转染的siRNA-PKD2能有效地抑制p65的核转位

讨论

结论

参考文献

中英文缩略词对照表

硕士研究生期间研究成果

致谢

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